解离液使用说明书
货号：B11140/B11050/B11120/B11130
英文名称： Isolation Buffer
规格：100ml
保存：4℃，有效期12个月。
产品说明：
细胞核是一个功能单位，完整的保存了遗传物质，并指导RNA的合成。RNA是蛋白质及其他细胞组分合成所必须的。在大多数细胞类型中，由于核被膜与内质网的连续性以及细胞核表面与细胞骨架之间的连接等原因，细胞核是被固定于细胞中的。流式细胞术是一种快速、准确、高效的测定和分析细胞DNA含量的方法，近年来已广泛应用于植物研究中，如细胞周期分析、植物倍性鉴定、染色体分拣、细胞核DNA含量测定、生殖途径鉴定、DNA变异分析、遗传稳定性分析和体胚发生分析等。只通过物理方法即切碎叶片往往不能获取大量完整的细胞核，还需要加入一些特定成分的缓冲液，使植物细胞破损，分散细胞器，进而解离出细胞核，为后续的核DNA提取和DNA含量分析做准备。流式细胞术测定的生物细胞必须处于单细胞悬液状态，制备优质的细胞核悬液的关键在于选择合适的细胞核分离缓冲液。
不同植物的组织结构和化学成分存在较大差异，使用细胞核分离缓冲液的效果不同，而且目前没有一种普遍适用的细胞核分离缓冲液，因此需要尝试不同的缓冲液，甚至改进其成分，以获得最佳的细胞核分离效果。
使用方法（仅供参考）：
一、细胞核微量提取方法：
1、取新鲜的植物样品0.1～0.5g，用蒸馏水冲洗，滤纸吸干水分，用锋利的刀片切碎，置于匀浆器中，加入2mL解离液，匀浆1～2min。
2、用2层无菌平纹纱布过滤匀浆物，再用2mL解离液冲洗匀浆器和纱布，合并滤液。
3、室温下70r/min离心5min，转移上清液至新离心管中，700r/min离心15min，去除上清液，保留下层细胞核沉淀。
4、核沉淀可重新悬浮于HEPES缓冲液中，-70℃保存，用于核裂解、核DNA提取和纯化等下游实验。
二、Otto解离两步法：
1. 分别取内标植物和黄芩叶片约1cm2放到培养皿中，加入4℃保存备用的OttoⅠ提取液1mL，用锋利的单刃刀片垂直快速切碎叶片；
2. 混匀后用枪头吸取提取液经30um的滤头过滤到1.5mL的离心管中，4℃、1000g离心5min，小心吸弃上清；
3. 加入500uL Otto II溶液（临用前加入0.02mg/mL RNase A+0.02mg/mL PI）备用。
三、LB01一步法（其他解离液可参照此解离步骤）：
1. 同两步法取材后，加入分装解冻后的LB01提取液1mL，快速切碎和过滤得细胞核悬液；
2.在上机测试前约5min，每管加入20uL的RNase储存液（1mg/mL）和20uL的PI储存液（1mg/mL）。
注意：上述操作中，刀片要锋利，材料要浸入提取液，垂直快速切碎，解冻的PI和加入PI的细胞核悬液，均需要冰上低温避光保存，每个样品需要3个重复。
荧光染料选择：
Hoechst 33342，Hoechst 33258和DAPI属于非嵌入式染料，主要结合在DNA的A-T碱基区，因此此类染料不适合于检测基因组绝对值，实际测量值偏小。但是可以获得高分辨率的柱状图，可以用于倍性水平检测。
PI，EB，AO为嵌入式染料，在检测核DNA的含量前，需要先降解RNA，排除双链RNA的干扰，此类染料只能染死细胞，也可以用来区分活死细胞。
注意事项：
1、样品量过少或者匀浆不充分可能会导致获得的细胞核很少，影响下游实验。
2、解离液选择不合适、样品保存不当、样品反复冻融、提取过程过分剧烈都可能导致提取的DNA断裂或降解。
3、“不同解离液的成分及作用”和“不同解离液的成分及适用的样本”见附表。
4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
不同解离液的成分及作用
成分 | 作用 | 注释 | 相关的解离液 |
氯化镁、硫酸镁 | 稳定核染色质 | 镁离子 | G、T、H、W、m |
精胺、亚精胺 | 稳定核染色质 | 精胺 | L、GP |
氯化钾、氯化钠 | 提供一定的离子强度，维持渗透压 | 无机盐 | H、W、L、GP、M |
曲拉通 | 释放核，移走细胞质，分散叶绿体，减少核粘连 | 表面活性剂 | G、T、H、W、L、m、GP |
吐温 | O、M | ||
EDTA | 结合作为核酸酶辅助因子的二价阳离子，抑制核酸酶活性 | 金属螯合剂及替代物 | W、L、m、M |
柠檬酸钠 | G、GP、O、m、M | ||
葡萄糖 | 维持核的完整性，防止核粘连 | M | |
Tris | 维持核的完整性，防止核粘连，稳定溶液的pH | 缓冲剂 | T、W、L、 |
MOPS | 稳定溶液的pH | 缓冲剂 | G、m、GP |
HEPES | H、M | ||
PVP | 消除酚等粘性物质的影响 | W、m | |
DTT | 保护染色质蛋白，消除酚等粘性物质的影响 | 还原剂 | H |
2-巯基乙醇 | L、m、M | ||
焦亚硫酸钠 | W |
不同解离液的成分及适用的样本
解离液名称 | 成分 | 成功测定的样本 |
Galbraith解离液 | 氯化镁、柠檬酸钠、MOPS、曲拉通 | 松属，番茄，杉木 |
Tris-MgCl2解离液 | Tris、氯化镁、曲拉通 | 矢车菊，欧洲朴树 |
HEPES解离液 | HEPES、硫酸镁、氯化钾、DTT、曲拉通 | 杉木 |
WPB解离液 | Tris、氯化镁、EDTA、氯化钠、焦亚硫酸钠、PVP、曲拉通 | 虞美人，意大利松，欧洲李，桃，梨，夏栎，蔷薇，葡萄，垂柳 |
LB01解离液 | Tris、精胺、EDTA、氯化钠、氯化钾、曲拉通、巯基乙醇 | 蚕豆，山药，罗勒属，欧洲云杉，茄子，番茄 |
mGb解离液 | MOPS、PVP、氯化镁、EDTA、柠檬酸钠、曲拉通、巯基乙醇 | 千里光属，拟南芥 |
GPB解离液 | 精胺、柠檬酸钠、氯化钾、氯化钠、曲拉通、MOPS | 胡杨，灰叶胡杨，虎榛子，豌豆，马鞍藤，葱 |
OTTO解离液 | 柠檬酸、吐温、磷酸氢二钠 | 沙棘属，毛茛科，杉木 |