ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒

ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书

注意：本产品试剂浓度发生变化，使用前请仔细阅读说明书。

货号: C01870

规格：20T/50T/100T

保存：2-8℃，避光保存，有效期1年。

产品组成：

产品说明（仅供参考）:

该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

磷脂酰丝氨酸（PS）是⼀种带负电荷的磷脂，正常细胞中，PS只分布在细胞膜脂质双层的内侧，⽽在细胞凋亡早期，细胞膜PS由脂膜内侧翻向细胞膜外侧，使PS暴露在细胞膜外表⾯。Annexin V是⼀种分⼦量为35~36kD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋⽩，与磷脂酰丝氨酸有⾼度亲和⼒，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之⼀。

该产品将Annexin V进⾏绿⾊荧光（FITC）标记，以标记了的Annexin V作为探针，利⽤荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发⽣。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是⼀种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜⽽使细胞核染红。因此采⽤Annexin V与PI双染的⽅法，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

需自备的仪器和用品：

微量移液器；PBS；不含EDTA的胰酶消化液；低速离⼼机；流式细胞仪

使用说明（仅供参考）

1. 细胞样品的准备：
2. 悬浮细胞：
3. 收集细胞⾄离⼼管中1000-2000rpm离⼼5min，⼩⼼去除上清。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心去除上清，可以残留约50µL左右的培养液，以避免吸走细胞。
4. ⽤1mL 4℃预冷PBS轻轻重悬细胞并计数，1000-2000rpm离⼼5min，⼩⼼吸除上清。
5. 再加⼊1mL 4℃预冷的PBS重悬细胞，1000-2000rpm离⼼5min，⼩⼼吸除上清。
6. 贴壁细胞：
7. 吸出细胞培养液⾄离⼼管中备用，PBS洗涤贴壁细胞⼀次，加⼊适量不含EDTA的胰酶细胞消化液消化细胞。
8. 室温孵育至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。
9. 加⼊以上步骤a中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离⼼管内，1000-2000rpm离⼼5min，⼩⼼吸除上清。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50µL左右的培养液，以避免吸走细胞。

注：加⼊的细胞培养液⼀⽅⾯可以收集已经悬浮的发⽣凋亡或坏死的细胞，另⼀⽅⾯细胞培养液中的⾎清可以有效抑制或中和残留的胰酶；残留的胰酶会消化并降解后续加⼊的AnnexinV-FITC导致染⾊失败。

1. ⽤1mL 4℃预冷PBS轻轻重悬细胞并计数，1000-2000rpm离⼼5min，⼩⼼吸除上清。
2. 再加⼊1mL 4℃预冷的PBS重悬细胞，1000-2000rpm离⼼5min，⼩⼼吸除上清。
3. ⽤去离⼦⽔按1:3稀释Binding Buffer（4mL Binding Buffer+12mL去离⼦⽔）为结合缓冲液；
4. 用250µL结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1×10⁶/mL；
5. 取100µL的细胞悬液于5mL流式管中，加入5µL AnnexinV-FITC，轻轻混匀，室温(20-25℃)避光孵育10min；
6. 上机前5min加⼊10µL碘化丙啶(PI)溶液，轻轻混匀；
7. 上机前在反应管中补加400µL PBS重悬细胞，避光保存，立刻进行流式或荧光显微镜检测。
8. 实验设计：
9. 空白管：阴性对照组细胞，不加Annexin V/FITC，碘化丙锭溶液(PI)。用于调节电压
10. 单染管：阳性对照组细胞，只加Annexin V/FITC。用于调节补偿
11. 检测管：处理的细胞，加Annexin V/FITC，碘化丙锭溶液(PI)。用空白管和单染管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。

结果分析：

1. 流式细胞仪分析：

FITC最大激发波长为488nm，最大发射波长525nm，FITC的绿色荧光在FL1通道检测；PI-DNA复合物的最大激发波长为535nm，最大发射波长为615nm，PI的红色荧光在FL2或FL3通道检测。用flowjo、CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点图，FITC为横坐标，PI为纵坐标。典型的实验中，细胞可以分成三个亚群，活细胞仅有很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光，晚期凋亡细胞有绿色和红色荧光双重染色。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，右下象限为早期凋亡细胞，右上象限是凋亡晚期细胞和坏死细胞。

1. 荧光显微镜分析：
2. 滴一滴用Annexin V-FITC/PI双染的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。

注意：对于贴壁细胞，可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。

1. 在荧光显微镜下用双色滤光片观察。AnnexinV-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。

常见问题：

1. Annexin V/PI凋亡检测的试剂盒能否检测人以外其他动物的细胞凋亡情况？

可以。因为Annexin V是与磷脂酰丝氨酸(PS)亲和，而PS在不同种属间没差异。在正常细胞中，PS只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，PS由脂膜内侧翻向外侧。

1. 贴壁细胞做凋亡用胰酶消化下来对细胞膜损伤？

低浓度胰酶消化，轻柔吹打贴壁细胞2～3次，离心机4℃ 1000rpm 5min离心，处理得当的话，胰酶造成损伤可以控制在5%以内，有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。

1. 贴壁细胞可以先染PI然后再消化下来吗？这样是否可以减小由于消化液造成的细胞膜破损而染上的PI的误差？

先加PI不仅染色是否每组都均匀充分很难判断，而且PI本身对细胞也是有毒性的，对实验结果影响会比胰酶大，不建议这样做。

1. 为什么只能用不含EDTA的胰酶消化贴壁细胞，用含EDTA的胰酶消化细胞对结果有什么影响？

因为Annexin V是⼀种Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋⽩，所以不能加入EDTA，防止EDTA螯合了Ca²⁺从而影响Annexin V，进而影响结果。

1. 为什么先加Annexin V后加PI？

用流式检测凋亡时，PI受时间的影响很大，因标记了PI后会加大细胞毒性，随着时间延长会导致PI的染色增加，特别是检测早期凋亡时，如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外，误差会明显加大。一般PI加上后立刻上机，然后在一个小时内检测完成。

注意事项：

1. 微量试剂需离⼼数秒将试剂收集⾄管底后再开盖取⽤。
2. Propidium Iodide（PI）有毒，操作时要带⼿套，使⽤时避免与⽪肤，眼睛和黏膜接触。
3. AnnexinV-FITC中含有剧毒成分叠氮化钠（NaN₃）,操作时要带⼿套，使⽤时避免与⽪肤，眼睛和黏膜接触。
4. 本试剂盒⽤于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量在1×10⁵～1×10⁶。
5. 染⾊后宜尽快检测，时间过⻓可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
6. AnnixinV检测凋亡细胞的⽅法适⽤于悬浮⽣⻓的细胞，如：淋巴细胞等细胞的检测。对于贴壁⽣⻓的细胞，由于在胰酶等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤，会造成较⾼的假阳性，⽽⽤细胞刮⼦会造成细胞粘连成团，⽽影响检测，可将胰酶消化后的细胞保存在含2%BSA的PBS中，防⽌进⼀步的损伤。尽管⽬前，包括国外也有⼀些单位采⽤该⽅法检测贴壁⽣⻓的细胞。暂不推荐⽤该⽅法检测。因为其重复性较差，且需要操作时⾮常⼩⼼。
7. 消化贴壁细胞残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC，最终导致染⾊失败。
8. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。
9. 产品信息仅供参考。本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。