Anne×inV Ale×a Fluor488/PI 凋亡检测试剂盒

Annexin V-Alexa Fluor 488/PI Kit 凋亡检测试剂盒

货号：C01880

规格：20T/50T/100T

保存：2-8°C 避光保存，勿冰冻

产品简介：

产品简介：

细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS 暴露在细胞膜外表面。PS 是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS 暴露在细胞膜外。Annexin V 具有易于结合到磷脂类如PS 的特性，对PS 有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS 转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以采用Annexin V 与PI 双染的方法，通过流式检测细胞早期凋亡。

Jurkat 细胞用紫外诱导凋亡后用Annexin V-Alexa Fluor 488/PI 双染流式分析图谱

操作步骤：

1. 细胞样品的准备：
   1. 对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含EDTA 的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm 左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50μl 左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清；
   2. 对于悬浮细胞：1000rpm 左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50μl 左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃ 预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清；
2. 用去离子水按1:3 稀释结合缓冲液(4ml 4x 结合缓冲液+12ml 去离子水)；
3. 用1x 结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1-5×10⁶/ml；
4. 取100μl 的细胞悬液于5ml 流式管中，加入5μl Annexin V/Alexa Fluor 488 混匀后于室温避光孵育5 分钟；
5. 加入10μl 20ug/ml 的碘化丙锭溶液(PI)，并加400μl PBS，立刻进行流式检测。

实验设计：

1. 空白管：阴性对照组细胞，不加Annexin V/Alexa Fluor 488，碘化丙锭溶液(PI)。用于调节电压；
2. 单染管：阳性对照组细胞，只加Annexin V/Alexa Fluor 488。用于调节补偿；
3. 检测管：处理的细胞，加Annexin V/Alexa Fluor 488，碘化丙锭溶液(PI)。用空白管和单染管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。

注意事项：

1. Annexin V 是与磷脂酰丝氨酸(PS)亲和，而PS 在不同种属间没差异。在正常细胞中，PS 只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，PS 由脂膜内侧翻向外侧；
2. 低浓度胰酶消化，轻柔吹打贴壁细胞2～3 次，离心机4℃1000rpm 5min 离心，处理得当的话，胰酶造成损伤可以控制在5%以内，有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。
3. 先加PI 不仅染色是否每组都均匀充分很难判断，而且PI 本身对细胞也是有毒性的，对实验结果影响会比胰酶大，不建议这样做；
4. Annexin V 是Ca 依赖的蛋白，所以不能加入EDTA，防止EDTA 螯合了Ca 离子从而影响Annexin V，进而影响结果。
5. 用流式检测凋亡时，PI 受时间的影响很大，因标记了PI 后会加大细胞毒性，随着时间延长会导致PI 的染色增加，特别是检测早期凋亡时，如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外，误差会明显加大。一般PI 加上后立刻上机，然后在一个小时内检测完成。两种方法都可以，但是按照我们操作步骤造成的误差会更小。