Anne×inV Ale×a Fluor647/PI 凋亡检测试剂盒

Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 凋亡流式检测试剂盒

货号：C01890

规格：20T/50T/100T

保存：2-8℃ 避光保存，勿冰冻

产品内容：

产品简介：

细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS 暴露在细胞膜外表面。PS 是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS 暴露在细胞膜外。Annexin V 具有易于结合到磷脂类如PS 的特性，对PS 有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS 转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以采用AnnexinV 与PI 双染的方法，通过流式检测细胞早期凋亡。

操作步骤：

1. 细胞样品的准备：
   1. 对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含EDTA 的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm 左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50μl 左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4°C 预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。
   2. 对于悬浮细胞：1000rpm 左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50μl 左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4°C 预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。
2. 用去离子水按1:3 稀释结合缓冲液（4 ml 4×结合缓冲液+12ml 去离子水）。
3. 用1×结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1-5×10⁶/ml。
4. 取100μl 的细胞悬液于5ml 流式管中，加入5μl Annexin V/Alexa Fluor 647 混匀后于室温避光孵育5 分钟。
5. 加入10μl 20μg/ml 的碘化丙啶溶液（PI），并加400μl PBS，立刻进行流式检测。

实验设计：

1) 未转染细胞

空白管：阴性对照组细胞，不加Annexin V/Alexa Fluor647，碘化丙啶溶液（PI）。用于调节电压。

检测管：处理的细胞，加Annexin V/Alexa Fluor 647，碘化丙啶溶液（PI）。用空白管和单染管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。

注：无需单染管Annexin V/Alexa Fluor 647 调补偿。

2) 转染GFP细胞

未转染空白管：未转染细胞，不加Annexin V/Alexa Fluor647，碘化丙啶溶液（PI）。用于调节电压。

转染GFP空白管：转染GFP对照组细胞，不加Annexin V/Alexa Fluor647，碘化丙啶溶液（PI）。用于调补偿。

检测管：处理的细胞，加Annexin V/Alexa Fluor 647，碘化丙啶溶液（PI）调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。

常见问题：

1、Annexin V/PI 凋亡检测的试剂盒能否检测人以外其他动物的细胞凋亡情况。

可以，因为Annexin V 是与磷酯酰丝氨酸（PS）亲和，而PS 在不同种属间没差异。在正常细胞中，PS 只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，PS 由脂膜内侧翻向外侧。

2、贴壁细胞做凋亡用胰酶消化下来对细胞膜损伤？

低浓度胰酶消化，轻柔吹打贴壁细胞2-3 次，离心机4°C 1000rpm 左右离心5min，处理得当的话，胰酶造成的损伤可以控制在5%以内，有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。

3、贴壁细胞可以先染PI然后再消化下来吗?这样是否可以减小由于消化液造成的细胞膜破损而染上的PI的误差?

先加PI不仅染色是否每组都均匀充分很难判断，而且PI本身对细胞也是有毒性的，对实验结果影响会比胰酶大，不建议这样做。
4、为什么只能用不含EDTA 的胰酶消化细胞，用含EDTA 的胰酶消化细胞对结果有什么影响？

因为Annexin V 是钙依赖的蛋白，所以不能加入EDTA，防止EDTA 螯合钙离子从而影响Annexin V，进而影响结果。

实验参考图：

Annexin V-Alexa Fluor 647

Jurkat 细胞用顺铂诱导凋亡后用Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 双染流式分析分析图谱