Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒

Calcein-AM/PI 活细胞/死细胞双染试剂盒说明书

货号：C01910

规格：500T

保存：-20℃ 避光干燥保存，一年有效。

产品组成：

产品说明：

Calcein-AM是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光（Ex=490nm, Em=515nm）。因其在传统的Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM（本身不发荧光）被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM 和CFDA)相比，由于Calcein, AM 细胞毒性极低，是最适合用于活细胞染色的荧光探针，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。

由于死细胞缺乏酯酶，Calcein-AM 仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。因此，Calcein-AM常常与死细胞荧光探针如碘化丙啶（PI）等联合使用，同时进行活细胞和死细胞的荧光双重染色。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿过活细胞的细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此PI 仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用545nm激发，仅可观察到死细胞。

本试剂盒的工作原理就在于Calcein-AM和PI的双重染料，来进行活细胞和死细胞的双重染色标记，从而进行活细胞和死细胞水平的分析。根据我司优化的实验体系，单次就200μl 细胞悬液进行染色，可以做500次检测。

操作步骤（仅供参考）：

1. 工作液的配制

1.1 1×Assay Buffer（反应缓冲液）的配制

从低温冰箱内取出10×Assay Buffer，根据单次用量无菌条件取出适量，用去离子水（dH₂O）做10 倍稀释以得到1×Assay Buffer。

1.2 1×染色工作液的配制

1）先将低温保存的Calcein-AM 溶液(2mM)和PI 溶液（1.5mM）回到室温20-30min。

注意：第一次使用可对母液进行分装，以减少反复冻融次数。

2）取5μl Calcein-AM 溶液(2mM)和15μl PI 溶液（1.5mM）加入5ml 1×Assay Buffer，充分混匀。此时得到Calcein-AM 的工作液浓度为2μM，PI 的工作液浓度为4.5μM。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定Calcein-AM 和PI 的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。

注意：由于Calcein-AM 的稳定性比较差，此染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。

2. 染色步骤

2.1 对于贴壁细胞，先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA消化细胞，之后离心收集细胞（1000rpm，3min）。对于悬浮细胞，直接离心（1000 rpm，3min）收集细胞。

2.2 去上清，用1×Assay Buffer 充分清洗细胞2~3 次，以充分去除残留的酯酶活性。

2.3 用1×Assay Buffer 制备细胞悬液，使其密度为1×10⁵~1×10⁶ 细胞/ml。

2.4 取100μl 染色工作液加入200μl 细胞悬液内，混匀，37℃孵育15min。

注意：如果需要，可延长孵育时间至30min。

2.5 荧光显微镜下使用490±10 nm 激发滤片同时检测活细胞（黄绿色荧光）以及死细胞（红色荧光）。另外，使用545nm 的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。

注意：可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度。

1. 用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育细胞10min，或者用70%乙醇孵育细胞30min，从而制备死细胞；
2. 用0.1-10μM 的PI 溶液进行死细胞染色，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。
3. 用0.1-10μM 的Calcein-AM 进行死细胞染色，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色。

注意事项：

1. 由于Calcein-AM 对湿度非常敏感，若是Calcein-AM 溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。Calcein-AM 工作液必须现配现用。
2. 碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作时一定要注意防护。若接触到皮肤，需要立即用自来水清洗。
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。