常规细胞膜标记试剂盒
货号: C01932
英文名称: Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit
PKH67标记细胞呈绿⾊荧光，荧光波长：λex=490 nm, λem=502 nm
储存条件：-20℃避光保存,有效期1年
产品说明:
荧光染料PKH67适⽤于常规细胞膜标记，是⼀种可对体外和体内细胞示踪的绿⾊荧光染料，通过与膜结构的脂质分⼦结合⽽标记细胞。PKH67对细胞毒性较小，荧光背景低，脂溶性⾼，能够轻易穿透细胞膜，有着强⽽稳定的绿⾊荧光。经PKH67标记的细胞可⽤于体外和体内增殖研究，且具有不会使邻近细胞染⾊的功能。在细胞分裂增殖过程中，PKH67的荧光强度会随着细胞的分裂⽽逐级递减，标记荧光可平均分配至两个⼦代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的⼀半，根据这⼀特性，它可被⽤于检测细胞增殖，细胞周期的估算及细胞分裂等⽅⾯。PKH67标记细胞的荧光⾮常均⼀，并且分裂后的⼦代细胞的荧光分配也更均⼀。在细胞分裂增殖过程中，PKH67标记荧光可平均分配⾄两个⼦代细胞中，荧光强度变为亲代细胞的⼀半，通过流式细胞仪根据荧光强度的不同，可检测出未分裂细胞，分裂⼀次(1/2的荧光强度)，⼆次(1/4 的荧光强度)，三次(1/8的荧光强度)，以及更多分裂次数的细胞。PKH67可检测分裂次数多达六次甚⾄更多。除了⽤于细胞增殖检测，PKH67还可以⽤于细胞的体外盒体内示踪，标记后荧光在胞内表达稳定，阳性标记率达98%以上，标记细胞形态良好，能有效地观察细胞在体外的诱导分化情况；或将标记的细胞注⼊体内，可以有效的显⽰移植细胞在活体组织中的迁移及分化。PKH67标记的细胞⽤于体内观察可以长达数周之久，它常被⽤来做活体细胞检测实验和⽤荧光电镜观察细胞长期活动的实验。PKH67 毒性较小，不影响细胞的增殖能⼒。此⽅法操作简单，且不⽤放射性同位素，不存在安全隐患。可以更快速，更准确和更安全地得到想要的实验数据。
由于炭尾长度更长，内部研究已经证明 PKH67 ⽐ PKH2 由更少的细胞间转移。在采⽤ PKH1 和 PKH2 进⾏的体内研究中，荧光强度都会缓慢损失。由于这是绿⾊细胞 linker 染料⽽⾮红⾊细胞 linker 染料出现的⾏为特征，因⽽PKH67 会出现类似的性质。不分裂细胞的体外细胞膜留存和体内荧光半衰期的关联性揭示，PKH67 的体内荧光半衰期为 10-12 天。其他具有类似半衰期的绿⾊细胞 linker 染料已经被⽤于监测 1-2 ⽉内的体内淋巴细胞和巨噬细胞运输，结果表明 PKH67 还可⽤于中等时长的体内跟踪研究。
染料可以稳定的与细胞膜脂质区结合并发出荧光，主要⽤于细胞体外标记、体外细胞增殖研究以及体内外的细胞示踪研究。PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。相⽐于PKH-67，PKH-26具有更长的半衰期，标记在兔红细胞上的PKH26半衰期长达100天以上。特别适⽤于体外增殖研究以及长期的体内细胞跟踪研究。PKH67标记细胞后通常⽤流式细胞仪进⾏细胞增殖检测。
试剂盒组份：
产品编号 | PKH67染料 | 稀释液C |
CS4109-0.1mL | 0.1 mL | 10 mL |
CS4109-1mL | 1mL | 60 mL |
CS4109-5mL | 5 mL | 120 mL |
注意事项：
●染⾊浓度根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少⽽异。
● 配制的PKH67母液极易⽔解，建议分装保存，≦-20℃冷冻⼲燥保存。
● PKH67 ⼯作液应现配现用，不能提前配制，因为PKH67吸⽔会分解，影响染色效果。
● PKH67 易被⽔解，在⽔溶液中会很快变质。母液请在使⽤过程中避免接触⽔。⼯作液在标记细胞的过程中和⽔接触是在许可的时间范围内的。
● PKH67荧光染⾊剂为⼄醇溶液，在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固⽽粘在离⼼管管底、管壁或管盖内，从冰箱取出后恢复⾄室温，变成液体状态后离⼼⾄管底部再开盖。可以37℃⽔浴⽚刻⾄全部融解后使用。
● 不同的细胞种类标记后可以⽰踪的代次或时间差异较⼤，请根据实际情况或参考⽂献进⾏检测。
使用方法
1．染色液制备：
（1）从冰箱中取出PKH67试剂，静置几分钟至室温，或者37℃⽔浴⽚刻后，离⼼盛放PKH67 的管⼦，开盖前请务必离心几分钟让试剂充分落⼊管底后才能开盖。
（2）根据需要检测的细胞样品数，⽤稀释液将探针10倍稀释，再⽤合适的溶液(如：⽆⾎清培养基，HBSS或PBS)将PKH67母液25倍稀释，配制成染⾊⼯作液。最佳⼯作液浓度请根据不同细胞和⾃⾝的实验体系来调整。⼀般细胞使⽤按试剂盒中的⺟液的终浓度250倍稀释即可，有些细胞可能需要适当增加浓度。
2. 细胞染色
（1）将制备好的待测细胞⽤100μL染⾊⼯作液重悬，⾄细胞浓度⼤约107/mL。也可以进⾏原位染⾊，染⾊液⾜够覆盖细胞即可。
（2）在2～8 ℃培养细胞 15～30分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。
建议待标记细胞在染⾊⼯作液中于37℃孵育5min，再于4℃孵育15min。
低温孵育可降低细胞对染料的内吞作⽤，有助于染料对质膜的标记，并且降低染料定位细胞质囊泡的可能性。
（3）离心后去上清，收集细胞，⽤PBS或无血清培养基洗涤细胞1-2次，最后加入PBS或无⾎清培养基重悬细胞。
（4）取500μL 细胞悬液，⽤流式细胞仪检测。Ex/Em=490/502nm。
（5）随后还可按照细胞的正常培养⽅法进行培养。
（6）可以在荧光显微镜下直接观察标记效果，也可以在培养适当时间后再用流式细胞仪检测细胞增殖，或用于其他特定实验目的的细胞荧光示踪。
三. 外泌体染色
外泌体作为细胞外囊泡（Extracellular vesicle; EV）的一种，与癌症的恶化与转移密切相关， 外泌体相关的研究也 逐渐成为了关注的热点。为了研究通过外泌体的细胞间通信，细胞摄入外泌体时的示踪技术非常重要。PKH26和PKH67作为新型荧光染料，可满足多重染色在内的各种实验需求。
外泌体蛋白定量：取适量外泌体进行BCA蛋白浓度测定以确定外泌体蛋白量。
配制PKH工作液：用稀释液C将PKH稀释10倍，配制成工作液（现配现用）
准备细胞：将细胞接种到培养皿中，并在 37°C 5% CO2 培养箱中预培养—段时间。
Exosome 染色
表 1. 染色时所需的 Exosome 的量
外泌体蛋白量 | 10～200μg |
PKH工作液用量 | 50uL |
*上述外泌体的量是使用超速离心法获得的外泌体的大概的量。
*染色所需的外泌体的量因外泌体纯化条件和细胞种类而异。第一次染色时，请预先摸索外泌体的最佳用量。
*通过聚合物沉淀获得的外泌体会受到剩余聚合物的影响，因此无法用本试剂盒染色。
1. 吸取 100 uL悬浮于 PBS 中的外泌体至微型管中。
2. 吸取 2 uLPKH工作液 至步骤 1 的溶液中，并用涡旋混合器充分混合。
3. 在 37℃下培养 30 min。
4. 将全部溶液转移至过滤管中。
5. 在室温下以 3,000 x g 离心 5 min。
6. 向过滤管中加入 100 uL PBS。
7. 在室温下 3,000 x g 离心 5 min。
8. 再次重复步骤 7 和 8。
9. 在室温下以 3,000 x g 再次离心 5 min，以使剩余溶液滤净。
10.*当离心速度>3,000 x g 时，外泌体也会通过滤膜，导致回收量降低。如果溶液仍然存在，请重复离心直至所有溶液滤净。
11. 吸取 50 uLPBS 至过滤管中，注意枪头不要碰触到未反应的染料，轻轻吹打，并将收集的染色后外泌体转移到新微 型管中。
*由于未反应的染料也保留在滤膜上，枪头如果直接接残留的染料可能会造成污染。
向细胞中添加外泌体
12. 去除培养基，并用 PBS 洗涤 1 次。
13. 去除 PBS，然后加入新鲜的含血清培养基。
14. 吸取 1-50 uL染色的外泌体至细胞中，并在 37℃ 5% CO2 培养箱中培养 1-24 h。
15. 去除上清液，用 PBS 洗涤 2 次。
16. 去除 PBS，加入新鲜的含血清培养基，用荧光显微镜观察。
⽤ HeLa 细胞观察荧光强度随外泌体添加量和培养时间的变化
1. 将 HeLa 细胞（1.25×104 个细胞/孔）接种在 μ-Slide 8 Well Plate上，并在 37℃ 5% CO2 培养箱中过夜培养。
2. 去除培养基，用 PBS 洗涤 1 次，并加入 200 uL新鲜的含 10% FBS 的 DMEM 培养基。
3. 将已用 ExoSparkler 外泌体膜染色试剂盒染色并纯化过的外泌体（5 /10 μg 蛋白，粒子数为 50/100x108个），加入 到含有 Hela 细胞的孔中。
4. 在 37℃ 5% CO2 培养箱中培养 2 或 4 h。
5. 去除培养基，并用 PBS 洗涤 2 次。
6. 去除 PBS，加入 200 uL新鲜的含 10% FBS 的 DMEM 培养基，用荧光显微镜观察。
*用超速离心从悬浮细胞 HEK293 的上清液中纯化外泌体并使用。
*用 BCA 法测量蛋白质的量，并且通过 Nanoparticles Tracking Analysis (NTA)测量粒子数。