Ki67 细胞增殖检测试剂盒（IHC）说明书
货号：C01970
规格: 100T
产品简介
Ki67 是一种标记细胞增殖状态的核抗原，主要表达于 G1 期, S 期, G2 期, 及有丝分裂间期的细胞，但在 G0 期的细胞中不表 达。其功能与细胞增殖密切相关，因此 Ki67 常用于检测肿瘤细胞的生长指数。
试剂盒组分
组成 | 100T |
组分 A: Anti-ki67 Rabbit antibody | 100µL×1 |
组分 B: HRP-conjugated Donkey anti-Rabbit IgG | 100µL×1 |
组分 C: Blocking Buffer | 15mL×1 |
组分 D: DAB Buffer | 5mL×1 |
组分 E: DAB Substrate (20 X) | 250µL×1 |
组分 F: DAB Chromogen (20 X) | 250µL×1 |
说明书 | 1 |
保存条件
组分 C 在 2-8℃避光保存，其它组分在-20℃保存。
使用方法（仅供参考）
自备试剂：
洗涤缓冲液：磷酸盐缓冲盐水（PBS ，pH7.4）
固定液：4%多聚甲醛溶解于 PBS 中， pH7.4，新鲜配制；
通透液： 0.1%-0.5%的 Triton X-100 溶解于 0.1%柠檬酸钠溶液,新鲜配制
注意：在染色过程中，要保证样品不能变干。 |
对于贴壁细胞
1. 固定： 将处理好的细胞爬片用 4%多聚甲醛室温固定 30-60 分钟。
2. 洗涤： PBST 洗 2 次， 每次 5 分钟。
3. 通透： 0.1%-0.5% 的 Triton X-100 室温透膜 10-15 分钟。
4. 洗涤： PBST 洗 2 次， 每次 5 分钟。.
5. 封闭：加适量 Blocking Buffer (组分 C) ，湿盒中室温孵育 30-60 分钟。
6. 洗涤： PBS 洗 2 次， 每次 5 分钟。
7. 加一抗： 按 1:50-1:200 用 Blocking Buffer (组分 C)稀释 Anti-ki67 Rabbit antibody （组分 A）； 每个爬片中加入稀释
好的 Anti-ki67 Rabbit antibody （组分 A），4℃湿盒中孵育过夜。
8. 洗涤： PBS 洗 2 次， 每次 5 分钟。
Rinse slides twice with PBS.
9. 加酶标二抗： 每个爬片加入适量 HRP-conjugated Donkey anti-Rabbit IgG （1:250-1:500）(Component B) ，室温，孵 育 60 分钟。
10. 洗涤： PBST 洗 2 次， 每次 5 分钟。
11. DAB 混合液的配制： 将 50 μL DAB Substrate (20 X) (Component E) 以及 50 μL DAB Chromogen (20 X) (Component F) 稀释到 900 μL DAB Buffer (Component D)中， 混匀。
12. 滴加 50 μLDAB 混合液到每个爬片上，避光， 室温孵育 5-10 分钟（视阳性组织显色情况判断）；
13. 终止显色：用蒸馏水终止显色反应。
14. 复染：每个组织滴加适量苏木素染液， 染色 1-5 分钟。
注意：苏木素复染的时间依赖于所用的苏木素。 |
15. 洗涤： ddH2O 洗 2 次， 每次 5 分钟。
16. 75% 、85% 、95%乙醇中室温依次各浸泡 5 分钟；
17. 二甲苯室温浸泡 15 分钟，
18. 中性树胶封片：加中性树胶盖玻片封片。
对于石蜡包埋的组织切片:
1. 按照标准操作过程进行固定， 脱蜡和水化；
2. 选择合适的抗原修复方法进行抗原修复；
3. 洗涤：用 PBS 室温清洗玻片 5 分钟。
4. 灭活酶处理：3% H2O2- 甲醇溶液，避光,室温处理 15 分钟。
注意：如果使用 HRP 偶联的抗体检测，这一步骤可以在这里也可以在加入一抗之后。 |
5. 洗涤： 蒸馏水洗涤 3 次， 每次 2 分钟；
6. 封闭：加适量 Blocking Buffer (Component C) ，湿盒中室温孵育 30-60 分钟。
7. 洗涤： PBS 洗涤 2 次， 每次 5 分钟。
8. 弃封闭液， 每个爬片中加入 Anti-ki67 Rabbit antibody（稀释比例：1:50） (组分 A) ，4℃湿盒中孵育过夜。
9. 洗涤： PBS 洗 3 次， 每次 5 分钟。
10. 加酶标二抗： 每个爬片加入适量 HRP-conjugated Donkey anti-Rabbit IgG（1:250-1:500） (Component B) ，室温，孵育60min
11. 洗涤： PBS 洗 2 次， 每次 5 分钟。
12. DAB 混合液的配制： 将 50 μL DAB Substrate (20 X) (Component E) 以及 50 μL DAB Chromogen (20 X) (Component F) 稀释到 900 μL DAB Buffer (Component D)中， 混匀。
13. 滴加 50 μLDAB 混合液到每个爬片上，避光， 室温孵育 5-10 分钟（视阳性组织显色情况判断）；
14. 终止显色：用蒸馏水终止显色反应。
15. 复染：每个组织滴加适量苏木素染液， 染色 5-10 分钟。
Counterstain slides 1-5 minutes with hematoxylin.
注意：苏木素复染的时间依赖于所用的苏木素。 |
16. 洗涤： ddH2O 洗 2 次， 每次 5 分钟。
17. 75% 、85% 、95%乙醇中室温依次各浸泡 5 分钟；
18. 二甲苯室温浸泡 15 分钟，
19. 中性树胶封片：加中性树胶盖玻片封片。
注意事项：
1、我司生产的生化试剂如无特殊标注，基本为非无菌包装，若用于细胞实验，请提前做好预处理。需低温保存的产品，一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。
2、产品信息仅供参考。本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。