活细胞Caspase-3活性与Annexin V细胞凋亡检测试剂盒
产品货号 | 试剂组成 | 20T | 50T |
C01990-1 | Annexin V-mCherry | 100μL | 250μL |
C01990-2 | GreenNuc™Caspase-3 Substrate (1mM) | 20μL | 50μL |
C01990-3 | Annexin V-mCherry Binding Buffer | 12mL | 30mL |
保存条件：
-20ºC保存，一年有效。 Annexin V-mCherry和GreenNuc™ Caspase-3 Substrate (1mM)避光保存。
产品简介：
> 活细胞Caspase-3活性与Annexin V细胞凋亡检测试剂盒(Caspase-3 Activity and Apoptosis Detection Kit for Live Cell)是基于新型的具有细胞膜通透性的Caspase-3/7绿色荧光底物GreenNuc™ Caspase-3 Substrate联合细胞凋亡红色荧光探针 Annexin V-mCherry来检测培养细胞中Caspase-3活性和细胞凋亡的红绿荧光双染试剂盒，可用于实时监测活细胞中Caspase- 3活性和凋亡情况。本试剂盒适用于流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测系统进行检测。
> 细胞凋亡(Apoptosis)是生物体发育等生命过程中普遍存在的、由基因决定的细胞主动有序的死亡方式。当细胞遇到内、外环境因子刺激时，启动基因调控的自杀保护措施，去除体内非必需细胞或即将发生特化的细胞。在这一过程中，细胞脱落 离体或裂解为若干凋亡小体，并迅速被巨噬细胞或邻近细胞清除，这是一种由基因控制、高度有序的细胞自主死亡，包含一系列信号事件组成的通路。细胞凋亡失调与多种疾病有关，例如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)和癌症等。
> Caspase (cysteine-dependent aspartate-specific proteases)的全称为天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶， 存在于蛋白质中，主要利用半胱氨酸(cysteine)侧链选择性地高效切割含有天冬氨酸(aspartate)的多肽底物，在介导细胞凋亡(apoptosis)过程中 起重要作用，并参与细胞的炎症、生长和分化等过程。 Caspase-3也称CPP32 、Yama或apopain，属于caspase家族的CED-3亚 家族(CED-3 subfamily) ，是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase 。Caspase-3是细胞凋亡过程中的一个关键酶，可以直接特异性剪切许 多 caspase 底物 ，包 括 PARP (poly ADP-ribose polymerase) 、 ICAD (Inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease) 、proCaspase-6 、7和9 、gelsolin和fodrin等。这些由Caspase-3介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要 组成部分。 同时Caspase-3还参与细胞核凋亡过程， 如染色质固缩(chromatin condensation) ，DNA片段化(DNA fragmentation) 等。 另外，Caspase-3对凋亡过程中的细胞起泡(cell blebbing)也起到了关键作用。
> GreenNuc™ Caspase-3为耦合DNA绿色荧光染料的多肽DEVD，该底物中的DEVD是caspase 3/7的识别序列， 并带有大量负 电荷。这些负电荷和DNA带有的负电荷相互排斥，使底物中的DNA绿色荧光染料不能结合DNA，也就不能被激发产生绿 色荧光。最初没有荧光的底物穿过细胞膜进入细胞质， 在凋亡细胞中被Caspase-3/7识别并剪切，释放出活化的DNA绿色荧 光染料分子。活化的DNA绿色荧光染料分子迁移进入细胞核， 与DNA结合后，形成GreenNuc™-DNA复合物，就可以被激 发而产生明亮的绿色荧光。
> 在正常活细胞中，磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)位于细胞膜的近细胞质面。而在凋亡细胞中， PS从质膜的内部外翻 到细胞表面即细胞膜外侧，从而使PS暴露于细胞外部。在白细胞的凋亡过程中，白细胞表面的PS标记可以被巨噬细胞识 别，从而最终被巨噬细胞吞噬。人血管抗凝血剂Annexin V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，分子量为35-36kDa，对PS具有 高亲和力。用带有红色荧光的mCherry标记的Annexin V (Annexin V-mCherry)染色细胞，就可以通过荧光显微镜、激光共聚 焦显微镜或流式细胞仪等荧光检测设备非常简单而直接地检测到PS的外翻这一细胞凋亡的重要特征。需要指出的是对于发 生坏死(necrosis)的细胞，由于细胞膜的完整性被破坏， 位于细胞膜内侧的PS也会被Annexin V-mCherry染色。 本试剂盒不区 分凋亡细胞和坏死细胞，如有需要，可参考C1062 Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒。
> 本试剂盒检测的是GreenNuc™-DNA复合物的绿色荧光和Annexin V-mCherry红色荧光，GreenNuc™-DNA的最大激发光波 长为500nm ，最大发射光波长为530nm； Annexin V-mCherry的最大激发光波长为587nm， 最大发射光波长为610nm 。 GreenNuc™-DNA复合物和Annexin V-mCherry的激发光谱和发射光谱参考图1。
图1. GreenNuc™-DNA复合物(绿色)和Annexin V-mCherry(红色)的激发光和发射光光谱。
> 本试剂盒中检测试剂配制后直接加入细胞中， 孵育15-30分钟后即可直接用于荧光显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪检测等 检测系统进行定性或定量检测。 正常细胞不会被GreenNuc™和Annexin V-mCherry所染色，Caspase-3活性高的凋亡细胞的 细胞核呈明亮的绿色荧光， 凋亡细胞会被Annexin V-mCherry染成红色荧光。使用本试剂盒检测Caspase-3/7活性和细胞凋亡 的效果参考图2。
图2. 活细胞Caspase-3活性与细胞凋亡检测试剂盒检测BGC-823细胞(人胃癌细胞) Caspase-3活性和细胞凋亡的效果。正常状 态的BGC-823细胞在明场下的形态见图A；正常细胞不会被GreenNuc™和Annexin V-mCherry所染色(图B-D) 。TS诱导3小时 后的BGC-823细胞在明场下的形态见图E；细胞内Caspase-3活性高的凋亡细胞核呈明亮的绿色荧光，凋亡细胞的细胞膜呈 红色荧光(图F-H) 。TS是由TNFα 、SM- 164组成的细胞凋亡诱导试剂(C0006S) 。实际检测效果会因实验条件、检测仪器的不 同而存在差异，本图仅供参考。
> 本试剂盒检测可以实时监测细胞内Caspase-3/7活性。传统的Caspase活性检测试剂盒， 通常需要裂解细胞或组织样品后进 行显色或荧光检测；通过Western检测Caspase本身和剪切后蛋白的表达情况，也只能检测Caspase的表达情况，从一定程度上反应酶活性；基于荧光标记的Caspase抑制剂的检测技术(fluorochrome-labeled inhibitors of caspases, FLICA)可以进入活细 胞检测Caspase活性，但其荧光探针本身就是不可逆的Caspase抑制剂， 所以无法在活细胞中实时监测Caspase的活力。 而本 试剂盒中提供的荧光底物GreenNuc™ Caspase-3对细胞活性没有明显的抑制作用，不影响Caspase的表达， 不抑制细胞的凋 亡过程， 有助于实时监测细胞凋亡。
> 本试剂盒功能强大。 使用本试剂盒检测Caspase-3/7的活性的同时，可以实时观察细胞核在凋亡过程中的形态学变化，还能 够检测细胞凋亡过程中PS外翻这一经典事件。在众多凋亡的细胞内，不同细胞可能处在不同阶段并经历着凋亡过程中的不 同事件，因而研究中很重要的一点就是能实时独立地跟踪这些事件，从而更好地了解事件之间的相互关系。本试剂盒可以通过荧光显微镜、流式细胞仪来研究这些不同事件的时间、空间关系。
> 本试剂盒小包装C1077S和中包装C1077M用于流式细胞仪分别可以进行20次和50次检测；用于96孔板每孔检测体系的体积 为100μl时分别可以检测40次和100次，检测体系体积为200μl时分别可以检测20次和50次。实际检测次数会因为检测体系和使用的底物浓度而有所不同。
注意事项：
> 避免微生物污染， 如有细菌或真菌污染， 会严重影响检测效果。
> 染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
> 如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意设法去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-mCherry，最终导致染 色失败。
> GreenNuc™ Caspase-3 Substrate不是很稳定，应尽量避免反复冻融(一般不要超过三次)。
> 用于流式细胞仪检测时，如果发现Annexin V-mCherry或GreenNuc™信号过强，并且通过调整相关设置和参数也无法改善，可以用PBS (C0221A)将Annexin V-mCherry或GreenNuc™稀释3- 10倍后再进行检测。
> 荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。
> 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
> 为了您的安全和健康， 请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
1. 对于悬浮细胞：
a. 在凋亡诱导结束后，1000 ×g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。 注： PBS重悬不能省略， 该 步骤起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-mCherry的结合。
b. 取5- 10万重悬的细胞， 1000 ×g离心5分钟，弃上清，加入194μl Annexin V-mCherry Binding Buffer轻轻重悬细胞。
c. 加入5μl Annexin V-mCherry和1μl GreenNuc™ Caspase-3 Substrate (1mM)，轻轻混匀。
d. 室温(20-25ºC)避光孵育20-30分钟， 孵育完毕后置于冰浴中。 注： 可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可以适当重悬细 胞2-3次以改善标记效果。
e. 随 即 进 行 流式 细 胞 仪检 测，GreenNuc™-DNA 为 绿色 荧 光(Ex/Em=500/530nm) ， Annexin V-mCherry 为 红色 荧 光 (Ex/Em=587/610nm)。如果用于荧光显微镜下检测，1000 ×g离心5分钟，收集细胞，用50- 100μl Annexin V-mCherry Binding Buffer轻轻重悬细胞，涂片后，荧光显微镜下观察。 注意：细胞在染色后须尽快完成检测，通常宜在1小时之内 完成检测。用于流式细胞仪检测时， 如果发现Annexin V-mCherry单独染色时出现了过多的GreenNuc™ Caspase-3假阳性 细胞，并且通过调整相关设置和参数也无法改善， 可以用PBS将Annexin V-mCherry稀释3- 10倍后再进行检测。
2. 对于贴壁细胞：
a. 在凋亡诱导结束后， 把细胞培养液吸出至一合适离心管内， PBS洗涤细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液(可含有 EDTA)消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞脱落为止，吸除胰酶细胞消化液，避免胰酶的过度消化。
b. 加入步骤2a中收集的细胞培养液， 稍混匀，转移到离心管内， 1000 ×g离心5分钟， 弃上清，收集细胞， 用PBS轻轻重悬 细胞并计数。 注： 加入步骤2a中的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养 液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-mCherry导致染色失败。
c. 取5- 10万重悬的细胞，1000 ×g离心5分钟，弃上清，加入194μl Annexin V-mCherry Binding Buffer轻轻重悬细胞d. 加入5μl Annexin V-mCherry和1μl GreenNuc™ Caspase-3 Substrate (1mM)，轻轻混匀。
e. 室温(20-25ºC)避光孵育20-30分钟，孵育完毕后置于冰浴中。 注： 可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可以适当重悬细 胞2-3次以改善标记效果。
f. 随 即 进 行 流式 细 胞 仪检 测， GreenNuc™-DNA 为 绿色 荧 光(Ex/Em=500/530nm) ， Annexin V-mCherry 为 红色 荧 光 (Ex/Em=587/610nm)。如果用于荧光显微镜下检测， 1000 ×g离心5分钟，收集细胞，用50- 100μl Annexin V-mCherry Binding Buffer轻轻重悬细胞，涂片后，荧光显微镜下观察。 注意：细胞在染色后须尽快完成检测，通常宜在1小时之内 完成检测。用于流式细胞仪检测时，如果发现Annexin V-mCherry单独染色时出现了过多的GreenNuc™ Caspase-3假阳性 细胞，并且通过调整相关设置和参数也无法改善， 可以用PBS将Annexin V-mCherry稀释3- 10倍后再进行检测。
3. 对于贴壁细胞的原位荧光显微镜检测：
注： 本方法的优点是可以原位观察细胞凋亡，缺点是部分凋亡由于不贴壁而检测不到。
- 选做：在凋亡诱导结束后， 对于培养于24孔板、 48孔板或96孔板的细胞进行离心，1000×g离心5min
b. 吸除细胞培养液，加入PBS洗涤一次。
c. 加入194μl Annexin V-mCherry Binding Buffer。
d. 加入5μl Annexin V-mCherry和1μl GreenNuc™ Caspase-3 Substrate (1mM)，轻轻混匀。
e. 室温(20-25ºC)避光孵育20-30分钟。可以使用铝箔进行避光。
f. 随 即 在 荧 光显 微 镜下 观 察， GreenNuc™-DNA 为 绿色 荧 光(Ex/Em=500/530nm) ， Annexin V-mCherry 为 红色荧光(Ex/Em=587/610nm) 。注意：细胞在染色后须尽快完成检测，通常宜在1小时之内完成检测。