EdU Apollo567 in vitro kit
货号：C02000
规格：100T
保存：室温运输，2-8°C储存，勿冻存，荧光试剂请避光保存，可稳定储存一年。
试剂 | 浓度 | 规格 |
EdU 溶液 (试剂A) | 1000× | 20μL |
Apollo反应缓冲液 (试剂B) | 20× | 500μL |
Apollo催化剂溶液 (试剂C) | 100× | 100μL |
Apollo荧光染料溶液 (试剂D) | 300× | 30μL |
Apollo缓冲添加剂 (试剂E) | 粉末 | 100 mg |
Hoechst 33342 (试剂F) | 100× | 150μL |
产品说明：
EdU（5-Ethynyl-2’- deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺 嘧啶（T）渗入正在复制的DNA 分子中，通过基于EdU 与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测细 胞DNA 复制活性，可快速准确的检测细胞的增值能力。与BrdU 检测方法相比，EdU 检测方法更 快速、更灵敏、更准确。EdU 与T 非常相似，而EdU 染料只有BrdU 抗体的1/500 ，在细胞内很容 易扩散，无需DNA 变性（酸解、热解、酶解等），可有效避免样品损伤，而且无需抗原抗体反应， 能在细胞和组织水平更准确地反映DNA 复制活性。
本试剂盒适用于体外培养细胞的增值检测。贴壁细胞宜采用荧光检测方式，适用于荧光显微镜、 共聚焦显微镜、高内涵筛选仪检测。悬浮细胞可在孵育 EdU 后进行涂片，涂片后从固定开始跟贴壁 细胞采用相同的染色检测流程。
实验准备：
1.1 × PBS (pH 7.2~7.6)
2.渗透剂(含 0.5% Triton X- 100 的 PBS)
3.甘氨酸溶液(2 mg/mL)（去离子水配置）
4.细胞固定液(含 4% 多聚甲醛的 PBS)
5.96/24/12/6 孔培养板或培养皿等
注意：请使用一次性手套，废液请妥善处理。
操作步骤（仅供参考）：
荧光显微镜检测方法（以96孔板，A549贴壁细胞为例）
1 、EdU标记
1. 1 用细胞培养基按 1000：1 的比例稀释 EdU 溶液 (试剂 A) ，制备适量 50μM EdU 培养基；1）EdU 浓度与孵育时间相关，短时间孵育（<2h）宜采用高浓度（10-50 μM），长时间孵育（>24h） 宜采用低浓度（1- 10μM）;
2）如果需配置 10 μM EdU 培养基，需调整为 5000：1 稀释比例；
3）配置好的培养基建议现配现用。
1.2 每孔加入 100 μL 50μM EdU 培养基孵育 2 小时，弃培养基；
1）最佳孵育时间与细胞周期相关（附表），大多数肿瘤细胞系均可采用 2 小时孵育时间； 2）EdU 培养基用量以没过细胞为宜，但需要保证 EdU 孵育时间内的营养物质持续供给；
1.3 PBS 清洗细胞 1-2 次，每次 5 分钟。
注：清洗目的是将未渗入 DNA 的 EdU 洗脱，清洗方式依据不同的细胞类型而定，贴壁不牢的细胞 请降低清洗强度。
2 、细胞固定化
2. 1 每孔加入 50 μL 细胞固定液 (即含 4% 多聚甲醛的 PBS)室温孵育 30 分钟，弃固定液；
1）低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构的保持，
2）可采用其他方式进行细胞固定。
2.2 每孔加入 50 μL 2 mg/mL 甘氨酸，脱色摇床孵育 5 分钟后，弃甘氨酸溶液； 注： 目的是中和多聚甲醛，保证染色反应体系；
当采用其他方式进行细胞固定时可酌情省略此步骤；
2.3 每孔加入 100 μL PBS ，脱色摇床清洗 5 分钟，弃 PBS；
2.4 每孔加入 100 μL 渗透剂(0.5% TritonX- 100 的 PBS)脱色摇床孵育 10 分钟；PBS 清洗 1 次，5 分 钟。
注：当实验需要进行其他抗体染色时，或由于某些细胞类型对染料的吸附性较高，可能需要增 强细胞膜通透性。
3 、Apollo 染色
3. 1 每孔加入 100 μL 的 1× Apollo 染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育 30 分钟后，弃染色反 应液；
1）染色液用量与细胞量相关，以覆盖细胞为宜；
2）孵育时间可以进行适当调整，调整范围为 10-30 分钟。
3.2 加入 100 μL 渗透剂(0.5% TritonX- 100 的 PBS) 脱色摇床清洗 2-3 次，每次 10 分钟，弃渗透剂；
3.3 （可选）每孔每次加入 100 μL 甲醇清洗 1-2 次，每次 5 分钟；PBS 清洗 1 次，每次 5 分钟。 注：由于某些细胞对染料的吸附性较高，需采用加强方式洗脱以降低染料背景。
4 、DNA 染色
4. 1 用去离子水按 100：1 的比例稀释试剂 F ，制备适量 1X Hoechst33342 反应液，避光保存；
4.2 每孔加入 100 μL 1X Hoechst 33342 反应液，避光、室温、脱色摇床孵育 30 分钟后，弃染色反 应液；
4.3 每孔每次加入 100 μL PBS 清洗 1-3 次；
4.4 客户可选择进行其他染色步骤，否则每孔加入 100 μL PBS 保存待用。
建议染色完成后立即进行观测；如果条件限制，请避光 4℃ 湿润保存待测，但不应超过 3 天。 若为细胞爬片或涂片，可使用抗荧光淬灭封片剂封片后 4℃保存及进行检测。实验参考
表1 EdU孵育时间设定参考
细胞系 | 人胚胎细胞 | 酵母细胞 | 人成纤维细胞 | 人宫颈癌细胞 | 人胚肾细胞系 | 人神经细胞 |
细胞周期 | -30min | -3h | - 18h | -21h | ~25h | -5d |
孵育时间 | 5min | 20min | 2h | 2h | 2h | 1d |
注：1）EdU 孵育时间取决于细胞周期，一般为细胞周期的 1/10 至 1/5 ，但大多数细胞系均可采用 2h 孵育时间；
2）考虑到细胞培养基、温度、湿度、光线等其他因素的影响，细胞周期会有所变化。
表 2 EdU 培养基及染色反应液的使用量参考
96 孔板 | 48 孔板 | 24 孔板 | 12 孔板 | 6 孔板 | 5.5 cm 小皿 | |
EdU 培养基 | 100 μL | 200 μL | 300 μL | 500 μL | 1 mL | 2 mL |
染色反应液 | 100 μL | 200 μL | 300 μL | 500 μL | 1 mL | 2 mL |
表 3 Apollo染色反应液的配置参考（现用现配）
配制顺序 | Apollo 染色反应液 | 500μL | 1 mL | 5 mL | 10 mL |
1 | 去离子水 | 469 μL | 938 μL | 4.69 mL | 9.38 mL |
2 | Apollo 反应缓冲液 (试剂 B) | 25 μL | 50 μL | 250 μL | 500 μL |
3 | Apollo 催化剂溶液 (试剂 C) | 5 μL | 10 μL | 50 μL | 100 μL |
4 | Apollo 荧光染料溶液 (试剂 D) | 1.5 μL | 3 μL | 15 μL | 30 μL |
5 | Apollo 缓冲添加剂 (试剂 E) | 5 mg | 9 mg | 44 mg | 88 mg |
注：1）按顺序配制适量 1× Apollo 染色反应液，以免破坏正常的反应体系(现用现配，30 分钟用完)；
2）试剂 E 为白色粉末，较难准确称量，称量误差范围可稍微放宽，但不应超过±20%。且其较易 氧化，使用后请旋紧管盖，如试剂出现棕黄色，则需报废或更换。
FAQ：
1. 什么样的信号才是真正的 EdU 阳性信号？
1）Apollo 染色信号与核酸染色信号（Hoechst 33342 或 DAPI 等核染信号）完全重合，或者与 核重合的信号明显强于胞浆上的信号（染料附着等）
2）一般部分细胞上的信号呈现上述特征，而不是全部细胞。
2. 整个细胞都有 EdU 信号，或背景信号很强。
1）染色后洗涤不充分，可尝试加强洗涤解决。
2）染色过程中干片，导致染料粘附严重。
3）多聚甲醛固定时间过长而未使用甘氨酸中和。
4）没有阳性信号曝光过度导致背景严重。
3. 没有阳性信号。
1）EdU 处理时间太短导致没有阳性信号。体外细胞实验一般 EdU 处理时间宜为细胞周期长度 的 1/5- 1/10 ，阳性率约为 20%-30% ，体内实验需根据目的组织细胞的增值速度进行调整，若细胞增值速度慢，需要采用长时间的 EdU 处理时间，
2）对于阴性结果，可设置阳性对照（常见肿瘤细胞株如 Hela EdU 处理 2 小时或者 EdU 处理 6 小时以上的小鼠小肠上皮组织）以确认染色过程无误，对于目的样品，可使用较长的 EdU 处理时间 以尽量先检测出信号，再根据具体信号比例进行 EdU 处理时间的调整。
3）染色过程干片，导致染料粘附严重
4. 细胞中表达 GFP ，Apollo 染色后检测不到 GFP 的荧光信号。
Apollo 染料会造成 GFP 的失活，故 Apollo 染色后无法直接检测 GFP ，建议可以使用 GFP 抗体 进行复染医间接检测 GFP。