ROS活性氧检测试剂盒-红色荧光说明书
货号: C02190
规格:100T
产品组成 ：
产品名称 | 包装 | 保存 | |
A 液 | 缓冲液 A | 100mL | 4℃ 避光保存，有效期⼀年 |
B 液 | 红色荧光染料 （5mM） | 0.2mL | |
Rosup | 阳性对照 | 1mL |
产品简介：
活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括超氧⾃由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多⽣理和病理过程。活性氧检测试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit） 是⼀种利⽤荧光探针进⾏活性氧检测的试剂盒。 本试剂盒利⽤红⾊荧光探针检测各种动物和植物样本的活性氧。红色荧光的活性氧探针的最大激发/发射波长510/610nm。探针可以用缓冲液稀释也可以使用无血清培养基进行稀释。
检测荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。根据活细胞中荧光的产生，可以判断细胞活性氧的含量和变化。⽤流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种经典的组织或活细胞中活性氧检测⽅法。试剂盒会提供活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。Rosup是⼀种混合物， 浓度为50mg/mL。Rosup 为活性氧阳性诱导药物，根据其荧光信号强度，可分析活性氧的真正⽔平。
本试剂盒只可以⽤于细胞和新鲜组织样本的活性氧检测，不可以⽤于冻存的组织样本的活性氧检测。本试剂盒本底低，灵敏度高，线性范围宽，使⽤方便。本试剂盒主要应用是定性检测，定量检测操作难度要求相对较高。
注意事项：
1. 探针装载后，一定要洗净残余的未进⼊细胞内的探针，否则会导致背景较⾼ 。
2. 阳性对照Rosup 一般使⽤浓度为100 μM （推荐浓度100-400 μM，具体依细胞类型⽽定）。通常刺激后0.5-4 h 可观察到显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较⼤的差别。如果在刺激后30min 内观察不到活性氧的升高，可延⻓诱导时间或适当提⾼活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升⾼得过快，可缩短诱导时间或适当降低活性氧阳性对照的浓度。
3. 对于某些特别的细胞， 实验过程中如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000-1:5000 稀释探针的终浓度为2-5 μM。探针装载的时间也可以根据情况在15-60 min 内适当进⾏调整。
4. 活性氧阳性对照(Rosup) 仅仅⽤于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加⼊活性氧阳性对照。
5. 探针装载完毕并洗净残余探针后， 可以进⾏激发波⻓的扫描和发射波⻓的扫描， 以确认探针的装载情况是否良好。
6. 尽量缩短探针装载后到测定所⽤的时间 （刺激时间除外），以减少各种可能的误差。
7. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴⼀次性⼿套操作。
8. 如果要进行定量实验，需要自行绘制标准曲线。先做⼀个不同浓度H2O2氧化荧光值，做⼀条标准曲线，X轴为H2O2浓度，y轴是荧光值，得出一个⽅程，再代入方程中计算，依据测定样品的荧光值即Y值是多少，对应的X值就是浓度。
9. 有的细胞装载探针后细胞容易漂起来，洗细胞时实验组会吸⾛⼀部分细胞。所以种细胞时细胞量增加⼀倍，这样细胞紧密连接，贴壁⽐较牢，实验组的荧光值就⾼了。另外的探针很敏感，⼯作液浓度要低⼀些，1-2μM就可以，浓度太⾼容易有⾮特异性染⾊。本试剂探针很不稳定，⼀旦氧化了本底荧光值就会升⾼，建议⼯作液最好现⽤现配。
10. 染⾊液为DMSO溶液，⽓温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要充分融解后使⽤，变成液体状态 后离⼼⾄管底部再开盖。
自备器材：
激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或流式细胞仪或荧光显微镜或荧光酶标仪激发波⻓ 488～ 535nm，发射波⻓ 610nm。
离⼼机，移液器，PBS 缓冲液/HBSS （不含酚红），蛋⽩定量试剂盒
组织样本使用参考：
1 ）样本处理：
刚取得的新鲜组织样本⽤PBS洗净。
准确称取50mg组织，加⼊1mL匀浆缓冲液A，⽤玻璃匀浆器充分匀浆。
在100×g， 4℃离⼼3分钟，弃沉淀，取上清。
2 ）样本检测：
在96孔板中加⼊200μL匀浆上清液、2μL DHE探针，⽤移液器吹打，使之充分混匀。
在37℃避光孵育30分钟。
置于荧光酶标仪中，后于激发波⻓为488～ 535nm、发射波⻓610nm检测荧光强度。
3 ）蛋白定量：
另取50μL上清匀浆液，⽤PBS⼤约稀释30倍。
取100μL进⾏蛋⽩定量。
4 ）结果处理：
以荧光强度/毫克蛋⽩表示组织活性氧强度。
细胞样本使用参考：
1. 装载ROS 探针
1.1 原位装载探针(仅适用于贴壁细胞)
a) 细胞准备：检测前一天进行细胞铺板，确保检测时细胞数量小于5×105/ml。
b) 药物诱导：去除细胞培养液，加入无血清培养基稀释的药物处理，于37℃细胞培养箱内避光孵育，实际诱导时间由药物特性和细胞类型决定。
c) （可选）阳性对照：先用无血清培养基等稀释阳性对照（Rosup, 100 mM）到常用工作浓度100 μM，加入细胞，37℃避光孵育0.5～4 h，以提高活性氧水平，不同细胞类型存在差异。例如：HeLa 细胞需孵育30-60 min，MRC5 人胚胎成纤维细胞则需孵育90 min。
d) ROS 探针准备：探针装载前按照1:1000 用无血清培养液稀释探针（红色荧光），使其终浓度为10 μM。
e) ROS 探针装载：吸除处理药物，加入适当体积稀释好的探针 工作液。加入的体积需充分盖住细胞。例如：6孔板通常不少于1000 μL，对于96 孔板通常不少于100 μL。37℃细胞培养箱内避光孵育30 min。
f) 细胞清洗：用无血清培养液洗涤细胞1～2 次，以充分去除未进入细胞内的探针。
1.2 收集细胞后装载探针(适用于贴壁细胞和悬浮细胞)
a) 细胞准备：按照标准方法培养细胞，必须保证检测用细胞状态。按照适当方法，清洗并收集足量的细胞。
b) 药物诱导：将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物，于37℃细胞培养箱内避光孵育，实际诱导时间由药物特性和细胞类型决定。
c) （可选）阳性对照：先用无血清培养基稀释阳性对照（Rosup, 100 mM）到常用工作浓度100 μM，加入细胞，37℃避光孵育0.5～4 h 以提高活性氧水平，不同细胞类型存在差异。例如：HeLa 细胞需孵育30-60 min，MRC5 人胚胎成纤维细胞则需孵育90min。
d) ROS 探针准备：探针装载前，按照1:1000 用无血清培养液稀释探针，使其终浓度为10 μM。
e) 探针装载：除去细胞内药物，离心收集细胞，加入稀释好的探针，使其细胞密度为1×106 ～ 2×107。
注意：细胞密度需根据后续的检测体系，检测方法，以及检测总量来进行调整。例如：对于流式分析，单管检测内细胞数目不少于104，也不可多于106。
f) 细胞清洗：用无血清细胞培养液洗涤细胞1-2 次，以充分去除未进入细胞内的探针。
2. 荧光显微照相操作方法
a) 对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞，取25-50 μL 细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。
b) 荧光显微镜下，选用FITC 滤光片观察荧光，去除背景观察荧光的变化。
3. 流式细胞分析操作方法
a) 对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用0.5-1 mL PBS 重悬细胞(0.5～1 x 105/ml)。
b) 依据具体实验要求，优化选择流式细胞仪通道，510nm 激发，测定610nm 的发射，细胞应可分成两个亚群：ROS 阴性细胞仅有很低的荧光强度，ROS 阳性细胞有较强的红色荧光。
注意事项:
本产品仅用于科研，不可用于其他。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。