活性氧检测试剂盒 Ros检测 绿色荧光 (DCFH-DA荧光法 )

活性氧检测试剂盒说明书

货号：C02200

规格：100T/500T

保存条件：-20℃避光保存，有效期1年。

产品内容：

产品简介：

活性氧检测试剂盒是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。根据活细胞中荧光的产⽣，可以判断细胞活性氧的含量和变化。⽤流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是⼀种经典的组织或活细胞中活性氧检测⽅法。

本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物，浓度为50mg/mL。Rosup为活性氧阳性诱导药物，根据其荧光信号强度，可分析活性氧的真正⽔平。本试剂盒本底低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便。

操作步骤（仅供参考）：

1. 装载ROS探针：

对于刺激时间较短（通常为2小时以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长（通常为6小时以上）的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。

原位装载探针（仅适用于贴壁细胞）：按照1：1000~1:10000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为1~10μmol/L。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1mL。37℃细胞培养箱内孵育15~60分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20～30分钟后可以显著提高活性氧水平。（注：建议设置探针稀释梯度，以确定最佳工作浓度）

收集细胞后装载探针（适⽤于贴壁细胞和悬浮细胞）：细胞收集后悬浮于无血清培养液中，调整细胞数量为1×10⁶至2×10⁷/mL，按照1∶1000～1:10000的比例加入DCFH-DA，使其终浓度为1～10μmol/L，37℃细胞培养箱内孵育15～60分钟。每隔3～5分钟颠倒混匀，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20～30分钟后可以显著提高活性氧水平。（注：建议设置探针稀释梯度，以确定最佳工作浓度）

说明：仅在阳性对照孔中加入Rosup作为阳性对照，其余孔不必加入Rosup。阳性对照可以按照1∶1000的比例使用。例如装载好探针的细胞共1mL，可以加入1 μL的阳性对照刺激。通常刺激后20～30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。(例如：HeLa 细胞需孵育30-60 min，MRC5⼈胚胎成纤维细胞则需孵育90min)。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。

1. 检测：

对于贴壁细胞样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或⽤胰酶消化制备成单细胞悬液后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

对于悬浮细胞样品可以取25-50 μL细胞悬液滴到⼀张显微载玻⽚上，再盖上⼀张盖玻⽚，选⽤FITC滤光⽚去除背景直接观察荧光的变化。也可以收集细胞后⽤0.5-1 mL PBS重悬细胞(0.5～1×10⁵/mL)用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

1. 参数设置

使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考下图。

注意事项：

1. 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
2. 探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。DCF的激发光谱和发射光谱请参考上图。
3. 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。
4. 有的细胞装载探针后细胞容易漂起来，洗细胞时实验组会吸⾛⼀部分细胞，这可能会导致实验组的荧光值偏低，所以种细胞时细胞量可以增加⼀倍。
5. 这个探针很不稳定，⼀旦氧化了本底荧光值就会升⾼，最好⼯作液现⽤现配。