Caspase-3 活性检测试剂盒说明书
比色法
货号：C02800
规格： 20T/18S 、50T/48S 、100T/96S
注意： 实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称/规格 | 20T | 50T | 100T | 保存条件 |
试剂一 | 液体 20 mL×1 瓶 | 液体 20 mL×1 瓶 | 液体 25 mL×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂二 | 液体 30 mL×1 瓶 | 液体 60 mL×1 瓶 | 液体 120 mL×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 液体 0.25 mL×1 支 | 液体 0.55 mL×1 支 | 液体 1.1 mL×1 支 | -20℃保存 |
标准品 | 液体 1mL×1 支 | 液体 1 mL×1 支 | 液体 1 mL×1 支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂一：分装-20℃保存。
2、 试剂二：分装-20℃保存。
3、 标准品： pNA 标准溶液， 5 mmol/L。标准溶液在 4℃条件下为浑浊状态， 溶解即可变为澄清状态， 不影 响使用。
4、 标准品稀释液配制： 取 9 mL 试剂一加入 1 mL 试剂二， 充分混匀待用。（也可按照试剂一： 试剂二=9:1 的比例，自行配制）。
产品说明：
Caspase 是参与细胞凋亡过程的蛋白酶家族， 包含 10 多个成员。 Caspase-3 是凋亡过程中最主要的终末蛋白酶， 也是研究最多 caspase；它激活 pro-caspase-2,6,7,9 特异水解多种关键凋亡蛋白如 PARP，介导染色质固缩、凋亡小 体生成、核 DNA 断裂。
测定原理基于 Caspase-3 特异水解多肽底物 DEVD-pNA (Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilide)，释放的游离硝基苯胺 pNA 在 405 nm 有最大吸收峰。采用可见光光度比色法测定 pNA 而得到 Caspase 活性。适用于检测哺乳动物 组织、细胞 Caspase-3 活性。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、100μL 玻璃比色皿/96 孔板、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、研 钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量， 具体比例可以参考文献）
1、培养细胞：先收集细胞到离心管内， 离心后弃上清； 按照细胞数量（约 106 个） 加 100 μL 试剂二（若裂解不充分可提高至 150-200 μL），震荡重悬沉淀， 置冰上静置 15 min，4℃ ，15000g 离心 10-15min，取上清置冰上待测。
2、组织： 按照组织质量（g）：试剂二体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1 g 组织，加入 1 mL 试 剂二），冰浴研磨或充分剪碎，置冰上静置 15 min ，4℃ ，15000g 离心 10-15min，取上清置冰上待测。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 405nm，蒸馏水调零。
2、 临用前用标准品稀释液将 5 mmol/L pNA 标准品稀释至 200 、100 、50 、25 、12.5 、0 μmol/L 的标准溶液待用。
3、 样本测定（在 96 孔板/EP 管中按顺序加入以下试剂）
试剂名称（μL） | 测定管 | 空白管 | 标准管 |
试剂一 | 40 | 40 | |
样本 | 50 | ||
试剂二 | 50 | ||
试剂三 | 10 | 10 | |
标准溶液 | 100 | ||
混匀， 盖紧 96 孔板盖子并用封口膜密封。 37℃孵育 60-120 分钟。 发现颜色变化比较明显时即可测定 405nm 处吸光值。如果颜色变化不明 显， 可以适当延长孵育时间， 甚至可以孵育过夜。空白管只需做 1-2 次。 计算 ΔA 测定=A 测定管-A 空白管。 | 立即测定 405nm 下吸光度 | ||
三、 Caspase-3 活性计算
1. 标准曲线的建立：
根据标准管的浓度（x ，μmol/L）和 ΔA 标准（y，减去浓度为 0 的空白管） 做标准方程。将 ΔA 测定代入标准 方程得到 x（μmol/L）。
2. 按酶活性增加百分比计算
Caspase-3 活性增加百分比= （实验处理组 A 测定-A 空白管） / （实验对照组 A 测定-A 空白管） ×100% 该方法简单可靠，可粗略反应酶活性情况。
3. 按酶活计算
参考 Chemicon 公司的 caspase 酶活力单位的定义： One unit is the amount ofenzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底 物饱和时，在 37℃一个小时内可以剪切 1nmol pNA 底物产生 1nmol 游离 pNA 的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的 caspase 酶活性。
Caspase-3 活性（U/mg prot）=x×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T×103=2x÷Cpr÷T
V 反总： 反应体系总体积， 0.1mL=10-4L；V 样： 加入的样本体积， 0.05mL；T：反应时间， h；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/mL；103：单位换算系数， 1μmol =103nmol。
注意事项：
1、由于试剂二中含有还原剂（DTT），建议将样品用水稀释 2 倍后， 用 Bradford 法测定蛋白浓度，以降低 DTT 对蛋白浓度测定的干扰。不建议使用 BCA 法测定蛋白浓度。
2 、Caspase 活性测定值低最常见的原因是细胞未发生凋亡或细胞量太少，其次是观测时间不恰当。诱导凋亡时， 并非剂量越大时间越长 Caspase 活性就越高。建议设置不同剂量和时间点如 0 、2 、4 、8 、16 、24 小时，以检测最佳的观察点。
3、所测样本的值高于标准曲线上限时，可用试剂二稀释样本后重新测定。
4、盖紧 96 孔板盖子并用封口膜密封。37 ºC 孵育，肉眼可见颜色变黄时的 OD405 值约为 0.2，此时即可测定。颜 色变化不明显可延长反应或过夜，但酶活性较强时，孵育时间过长将导致反应失去线性关系。
参考文献：
[1] Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J, 1997, 326: 1-16.
[2] Janicke R U, Sprengart M L, Wati M R, et al. Emerging role of caspase-3 in apoptosis[J]. Cell Death and Differentiation, 1999, 6:99-104.