人肿瘤浸润组织中性粒细胞分离液试剂盒

人肿瘤浸润组织中性粒细胞分离液试剂盒

货号：C06690

规格：200mL/KIT

保存：本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期 2 年。无菌开封后，保存于室温。

产品内容：

实验步骤：

1. 制备肿瘤浸润组织的单细胞悬液。

2. 细胞悬液体积小于5mL时，在离心管中先加入4mL试剂A，后将2mL试剂C小心叠加于试剂 A 之上，形成梯度界面（细胞悬液体积大于等于5mL，试剂A与试剂C比例2：1，试剂总量与稀释后的样本量相等。但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果），将细胞悬液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取细胞悬液，然后小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多，加样的时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。）

3. 室温，水平转子500~1000g，离心20~30min（细胞悬液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需摸索，离心转速最大不超过1200g）。

4. 离心后，离心管中将出现两层环状乳白色细胞层，上层细胞为单个核细胞层，下层细胞为中性粒细胞层，如图所示（个体差异或者是分离条件不同，粒细胞层可分离不明显）。

5. 用吸管小心吸取试剂C与试剂A之间以及试剂A中的中性粒细胞到15mL洁净的离心管中，10mL PBS或细胞洗涤液洗涤细胞。250g，离心10min（如有红细胞混杂则加入适量红细胞裂解液）。

6. 弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。

7. 重复步骤6

8. 弃上清，细胞重悬备用。

肿瘤浸润组织单细胞悬液的制备方法：

肿瘤浸润组织研磨的方法：

1. 无菌条件下摘取肿瘤浸润组织，撕去脏器被膜，用眼科剪将肿瘤浸润组织剪成小块。
2. 将尼龙筛网或者是细胞过滤筛放置于平皿上，加入少量全血及组织稀释液（保证肿瘤浸润组织及获得的细胞处于液体环境中）。
3. 将肿瘤浸润组织放置于筛网上，使用注射器活塞或者是无菌镊子来研磨肿瘤浸润组织（尽量控制研磨力度，保持筛网悬空，避免在皿底上直接研磨而造成大批细胞死亡）。
4. 研磨完全后使用全血及组织稀释液冲洗筛网，收集细胞悬液，再经滤网过滤。

注：

A. 可用酶消化法，使用胶原酶对肿瘤浸润组织组织进行消化，得到单细胞悬液。

B. 如果最终得到的细胞需要培养，那全过程所需试剂与器材均要求无菌。

C. 根据肿瘤浸润组织的体积控制单细胞悬液的浓度在10⁸~10⁹个/mL。

注意事项：

A. 开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物污染。

B. 分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。4℃或者是温度较低的条件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。

C. 洗涤细胞，不可使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养液，其成分会导致血细胞凝集，大大降低细胞得率及纯度。

D. 部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其带有的静电作用，可能会导致细胞挂壁，影响分离效果。

E. 如果要进一步对分离的细胞进行培养，那在收集血液和分离过程中，注意无菌操作，避免微生物污染。

F. 不同动物血液在不同比重分离液中的细胞离散系数及细胞带电不同，用户在制定分离液时应提供所需分离液的比重、动物种属及被分离细胞的名称。

参考文献

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2. Ting A, Morris PJ. A technique for lymphocyte preparation from stored heparinized blood. Vox Sang. 1971 Jun; 20(6): 561-3.
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