货号: D00280
规格: 100mL/500mL
保存条件: 开封使用后建议2-8℃密封保存，本试剂自订购之日起九个月内有效。
产品说明：
考马斯亮兰G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（Imax），由465nm 变为595nm，在一定的浓度范围内，测定的吸光度值A595 与蛋白质浓度成正比。Bradford 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，样品中巯基乙醇的浓度可高达1M，二硫苏糖醇的浓度可高达5mM，但受略高浓度的去垢剂影响，需确保SDS 的浓度低于0.1%，Triton X-100 低于0.1%，Tween 20、60、 80 低于0.06%。含去垢剂的样品推荐使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒。
需要自备试剂:
PBS、BSA 标准品(5mg/mL）
操作步骤:
一．微孔酶标仪法
1. 完全溶解蛋白标准品，取10μL，稀释至250μL，使终浓度为0.2mg/mL。待测蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl 或PBS 稀释标准品。
2. 5×G250 染色液使用前请颠倒3-5 次混匀，取1mL 5×G250 染色液，加入4mL 双蒸水，混匀成1×G250 染色液，此1×G250 染色液可在4℃保存一周。
3. 将标准品按0，2，4，6，8，12，16，20 微升分别加到96 孔板中，加PBS 稀释液补足到20 微升。
4. 将样品作适当稀释（最好多做几个梯度，如作2 倍、4 倍、8 倍稀释），加20 微升到96 孔板的样品孔中。由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2后。
5. 各孔加入200 微升稀释后的1×G250 染色液，室温放置3-5 分钟。
6. 用酶标仪测定A595，或560-610nm 之间的其它波长的吸光度。
7. 根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。
二．分光光度计法
如无酶标仪，染色反应可在离心管中进行，反应液混匀后加入比色皿中，使用分光光度计测定吸光值。
步骤如下：
1. 取八支（或者更多）干净的10mL 离心管，标记上号。
2. 取100μL BSA 加入PBS 2.4mL 稀释至终浓度为0.2mg/mL。
3. 5×G250 染色液使用前请颠倒3-5 次混匀，取10mL 5×G250 染色液，加入40mL 双蒸水，混匀成1×G250染色液，此1×G250 染色液可在4℃保存一周。
离心管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7（样品管 1） | 8（样品管 2） | 9（样品管 3） |
标准蛋白 BSA | 0μL | 100μL | 200μL | 300μL | 400μL | 500μL | 500μL适当稀释的样品 1 | 500μL适当稀释的样品 2 | …… |
PBS | 500μL | 400μL | 300μL | 200μL | 100μL | 0μL | 0μL | 0μL | 0μL |
1×G250染色液 | 5mL | 5mL | 5mL | 5mL | 5mL | 5mL | 5mL | 5mL | 5mL |
- 按下表加入试剂(以每孔5mL 计，多余的用来清洗比色皿)
- 应3 分钟后测OD 值。为了实验的准确性，可每间隔2 分钟加一管染色液，每间隔2 分钟测一管OD 值。如下表：
离心管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | …… |
加染色液（分钟） | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 | 14 | …… |
测 OD值 | 3 | 5 | 7 | 9 | 11 | 13 | 15 | 17 | …… |
