PAGE 胶蛋白微量回收试剂盒说明书
货号：D03090
规格：20 T
保存：所有试剂常温下运输，收到后所有试剂 2-8℃保存，溶液 B 避免火源，溶液 A 在低温下容易 形成沉淀，请在使用前 30℃加热，以促进溶解。
产品组成：
产品名称 | 规格 |
Buffer A | 10ml |
Buffer B | 60ml |
干粉 | 9.6g |
DTT | 40mg |
过滤柱 | 20 个 |
收集管 | 20 个 |
使用前将干粉和DTT 完全溶解于溶液A中，配完后4℃保存，每次使用时30℃加热，以促进溶解，混合好的溶液A尽量在一个月内使用完毕。
产品说明：
SDS-PAGE 不仅可用于检测蛋白质的相对分子质量，而且也是分离纯化蛋白质的重要工具之一， 随着蛋白质技术的微量化，有必要从凝胶中回收蛋白质以用于制备抗体、免疫印迹、氨基酸组分分 析或末端序列测定等，本产品就是专门为此用途开发的微量蛋白胶回收法，本产品适用于从考染， 铜染或锌染中回收蛋白质，回收效率在 50-80% ，能够使用 20 次。
产品特点：
1. 简单，不需要复杂而昂贵的仪器（如电洗脱仪） 。
2. 适用于变性胶（SDS-PAGE）和非变性胶（Native-PAGE）。
3. 回收率一般在50-80%之间（跟蛋白质大小，洗脱时间相关） 。
4. 跟后续的实验兼容，包括 1-D 、2-D 电泳和质谱测序等。
操作步骤：
1. 用手术刀片将铜染或锌染的胶块中含有目的条带的部分胶切下，放入1.5mL的离心管中，用相应 的消除液将胶中蛋白质条带脱色到胶体接近无色，室温12000 rpm（12830 g），离心5 min，尽量 去除上清，保留胶体。
对于考染或其他考染方法，直接将不需要脱色液脱色的或经过脱色液脱色的胶块中含有目的条 带部分切下，放入1.5mL 的离心管中，用双蒸水洗两次，每次5min ，再进行步骤2。
2. 用研磨杆将离心管中的胶体研磨成细小的碎片，加入400μL的溶液A ，在室温条件下，脱色摇床 上震荡过夜（ 16- 18 小时） ，期间取出，偶尔震荡几次。
3. 用 1mL 的去尖吸头吸取混合物至过滤柱中（将胶一起吸入，溶液过多时可分次加入），13,000rpm离心5分钟。将收集管中的滤出液转入新离心管中，加入2 mL 的预冷的溶液B ，混匀，4℃放置 30 min。
4. 室温 12000 rpm，离心 15 min，去除上清，再将离心管放置在通风厨中，待残留的液体挥发干净。 也可以再次加入 0.5 mL 的溶液 B，震荡洗涤沉淀，4℃放置 15 min，再重复步骤 4 一到两次，这样 得到的蛋白质更纯净。
5. 待液体挥发干净选用合适的缓冲液溶解沉淀的蛋白质，以方便进行后续的电泳和质谱测序等实验。
注意事项：
1. 在保证完全切取到目的蛋白质后，尽量去除多余的胶片。
2. 如果蛋白质的分子量较大，所加样的量较多，胶浓度比较大，可以适当延长温育时间。
3. 为了有比较好的回收效果，在进行胶中蛋白质回收时，每个点样孔中所加的蛋白质量最好在 2μg-40μg 之间。
4. 采用含有Urea 、Thiourea 、SB3- 10 等强溶解能力试剂的溶解液有助于沉淀蛋白的完全溶解。
5. 研磨杆研磨碎片时，越充分越好，这样有利于蛋白质扩散到溶液A 中。
6. 采用此试剂盒进行胶回收时，一般不建议采用银染，因为此时回收效率较低。
7. 目的蛋白回收效率与蛋白的分子量大小有一定的关系，在10KD 以下的多肽回收效率明显降低， 如果大于120KD ，则需要增加步骤2中的震荡过夜时间。
8. 如果在制浓缩胶时不加梳子，将蛋白溶液均匀的铺在浓缩胶面上进行电泳，之后将整个胶块从左到右的一条完整的目的蛋白条带切下回收，则需要按照常规梳子上所带点样孔的数量，将所用试剂按照倍数增加。
9. 所加溶液A 和溶液B 的体积需要保持一定的比例关系，溶液B 的体积必须是溶液A 体积5 倍或5 倍以上，以避免在步骤3的过程中产生不必要的杂质沉淀。
10. 过程中所加试剂量是针对 80×60×1mm 凝胶而定，若体积较大，可适当增加各溶液的体积。