膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒说明书
货号：D03380
规格：50T/100T
有效期：2-8℃保存，有效期一年。
产品内容：
名称 | 50T | 100T | 储存条件 |
组分 A：蛋白提取液 A | 10mL | 20mL | 2-8℃保存 |
组分 B：蛋白提取液 B | 20mL | 40mL | 2-8℃保存 |
组分 C：膜蛋白溶解液 C | 10mL | 20mL | 2-8℃保存 |
组分 D：蛋白酶抑制剂混合物 | 250μL | 500μL | 2-8℃保存 |
组分 E：蛋白稳定剂 | 100μL | 200μL | 2-8℃保存 |
注：
1. 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2. 蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3. 试剂拆封后请尽快使用完！
产品简介：
动物跨膜蛋白承担各种生物功能，在疾病的发生、发展过程中扮演重要角色。膜蛋白样品的制备需要充分考虑到与下游的胶分析及质谱分析等应用配套，因此膜蛋白样本制备成为一个难以逾越的挑战。
膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒是一种高效的高产膜蛋白提取试剂盒。本试剂盒提供全套试剂，适用于从细胞和动物组织提取膜蛋白和胞浆蛋白。提取过程简单方便。
本试剂盒提取的蛋白可用于 Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift 凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。
本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。
本试剂盒中不含有 EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。
自备试剂和仪器：
离心机、振荡器、匀浆器、涡旋混匀器、移液器、冰箱、冰盒，PBS缓冲液、蛋白定量试剂盒，离心管、吸头、一次性手套
产品特点：
1、使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
2、含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
3、紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
4、蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含 6 种独立的蛋白酶抑制剂，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
使用方法：
一、使用注意事项：
1. 正式实验前请选取几个样本做预实验，以优化实验条件，取得最佳实验效果。
2. 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
3. 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
4. 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
5. 如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
6. 提取液A在使用前须一直置于2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
7. 膜蛋白电泳时loading buffer应该避免煮沸。
8. 膜蛋白电泳时可以提高 loading buffer的SDS含量。
9. 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
10. 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
二、细胞蛋白提取：
1. 提取液制备：
每500μl 冷的蛋白提取液 A 中加入 2μl 蛋白酶抑制剂混合物，2μl 蛋白稳定剂，混匀后置冰上备用。
每 500μl 膜蛋白溶解液 C 中加入 2μl 蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取 5-10×106个以上细胞，在 4℃，500×g 条件下离心 2-3 分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
3. 用冷 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 细胞样品中加入 200μl 冷的试剂 A，高速涡旋振荡 5 秒，置 2-8℃振荡 30 分钟-1 小时。
5. 再次高速涡旋振荡 5 秒，然后在 4℃，13000×g 条件下离心 5 分钟。
6. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，37℃水浴 10 分钟，37℃条件 2000×g 离心 3 分钟，此时溶液分为两层，下层约为 20-50μl。
7. 小心收集上层，即为胞浆蛋白。下层为膜蛋白。
8. 用 150-200μl 冰冷的试剂 B 稀释下层膜蛋白部分，混匀后冰浴 2 分钟，然后 37℃水浴 5-10 分钟，37℃条件 500-2000×g 离心 3 分钟，此时溶液分为两层，下层约为 20-50μl。
9. 小心移除上层，用 50-200μl 冰冷的试剂 C 溶解下层，即得膜蛋白。
10. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
三、组织蛋白提取
1. 提取液制备：
每 500μl 冷的蛋白提取液 A 中加入 2μl 蛋白酶抑制剂混合物，2μl 蛋白稳定剂，混匀后置冰上备用。
每 500μl 膜蛋白溶解液 C 中加入 2μl 蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
- 取适量组织样本用手术剪刀尽可能剪碎，加入冷的蛋白提取液 A，用组织匀浆机/匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体，将匀浆吸入另一预冷的干净离心管。
- 按照细胞蛋白的提取方法的第 3 步骤往下操作即可。
常见问题分析：
1.蛋白浓度低？
膜蛋白丰度比较低，在条件允许的情况下，需要尽可能加大细胞的上样量以提高膜蛋白浓度。
处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
2.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford 法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
3.膜蛋白电泳没有条带？
膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳时蛋白上样量足够。
膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。
蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。
蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%-10%。
有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。
电泳时最好采用低电压低电流电泳。
膜蛋白丰度通常较低，有条件可以尝试用银染染色。
注意事项：
- 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
- 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻
底清除残留清洁剂。
- 实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。
- 对于组织样品，本试剂盒适用于新鲜组织，对冻存组织抽提效果较差。
- 避免皮肤或粘膜与试剂接触，如果试剂不小心接触皮肤或眼睛，应立即用水冲洗。
- 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。