细菌膜蛋白/胞质蛋白提取试剂盒
货号：D03530
规格：50T/100T
有效期：2-8℃保存，有效期一年。
产品内容：
名称 | 50T | 100T | 储存条件 |
细菌胞质蛋白提取液A | 25ml | 50ml | 2-8℃保存 |
细菌膜蛋白提取液B | 250ul | 500ul | 2-8℃保存 |
膜蛋白溶解液C | 10ml | 20ml | 2-8℃保存 |
蛋白酶抑制剂混合物 | 100ul | 200ul | -20℃保存 |
注：
- 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
- 蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
- 试剂拆封后请尽快使用完！
产品简介：
细菌膜蛋白/胞质蛋白提取试剂盒可以从各种菌体中提取膜蛋白和胞质蛋白。提取过程简单方便。本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解细胞膜组份，试剂盒含有蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高质量的蛋白提供了保证。
本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。
本试剂盒中不含EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。
自备试剂和仪器：
离心机、振荡器、涡旋混匀器、移液器、冰箱、冰盒，PBS缓冲液、蛋白定量试剂盒，离心管、吸头、一次性手套
产品特点：
- 使用方便，从细菌中提取蛋白不需经过超声破碎等前处理。
- 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
- 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
- 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
- 本品可用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
- 本品不含EDTA，可以用于金属螯合层析等下游应用。
使用方法：
一、使用注意事项：
- 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
- 蛋白酶抑制剂在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或 37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
- 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
- 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
- 如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
- 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
- 下游实验如果是进行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性检测，提取液可以不加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，注意提取过程保持低温操作，缩短离心时间。
二、操作步骤
- 提取液制备：每500ul冷的提取液A中加入5ul提取液B和2ul蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置冰上备用。
- 离心收集菌体，用PBS洗菌体2次。
- 按每100-150mg湿重菌体样本加入500ul冷的提取液A（大约菌体和提取液体积比1:3-1:5，完全淹没菌体即可），吹打混匀，在2-8℃振荡1-2小时，至菌体裂解完全，液体澄清，菌体沉淀减少。
- 将菌液在2-8℃低温下12000×g离心5分钟，取上清。
- 在37℃水浴10分钟。
- 在37℃，1000×g离心3分钟。
- 此时液体分为2层，小心移除上层溶液，即得到胞质蛋白。
- 留管底部下层，大约50ul液体。
- 用50-200ul冷的膜蛋白溶解液溶解该下层溶液，即得细菌膜蛋白样品。
- 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
常见问题分析：
- 蛋白浓度低？
膜蛋白丰度较低，需要尽可能加大细胞上样量。处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
- 用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
- 提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
- 膜蛋白电泳没有条带？
膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。
膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。
蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。
蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%-10%。
有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。
电泳时最好采用低电压低电流电泳。
注意事项：
- 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
- 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
- 实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。
- 免皮肤或粘膜与试剂接触。如果试剂不小心接触皮肤或眼睛，应立即用水冲洗。