线粒体膜蛋白提取试剂盒

线粒体膜蛋白提取试剂盒

货号：D03580

规格：50T/100T

有效期：2-8℃保存，有效期1年。

产品内容：

注：

1. 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2. 蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3. 试剂拆封后请尽快使用完！

产品简介：

线粒体膜蛋白提取试剂盒提供全套试剂，适用于从各种动物原代或传代细胞和各种实体组织，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等动物组织中提取线粒体膜蛋白。

本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解线粒体膜组份。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。

本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gelshift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。

本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。

本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，需要除盐后再用于2D电泳。如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用其他货号的蛋白提取试剂盒。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用脱盐柱脱盐处理。

产品特点：

1. 使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
2. 将蛋白提取的时间缩短至1小时。
3. 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
4. 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
5. 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性。

使用方法：

一、使用注意事项：

1. 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
2. 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
3. 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
4. 最好使用标准Dounce匀浆器匀浆，如果没有标准Dounce匀浆器，用普通玻璃匀浆器匀浆也可，但是线粒体膜蛋白回收率可能会下降。
5. 最好用新鲜的细胞/组织样本，也可以用冻存的细胞/组织样本，但是线粒体膜蛋白回收率会下降。
6. 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
7. 提取液C在使用前须一直置于2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
8. 膜蛋白电泳时loading buffer应该避免煮沸。
9. 膜蛋白电泳时可以提高loading buffer的SDS含量。
10. 操作步骤

细胞样本：

1. 提取液制备：

每200ul冷的蛋白提取液C中加入1ul蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

每200ul冷的试剂D中加入1ul蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

【注】:

1. 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
2. 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
3. 提取液C在使用前须一直置于2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
4. 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
5. 取2×10⁷个细胞，在4℃，500×g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。贴壁细胞胰酶消化或直接刮下进行相应洗涤即可。

【注】:

1. 由于线粒体膜蛋白含量较少，需要较多的细胞才能保证得率。在条件允许的情况下，尽可能加大细胞上样量。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3. 加入400ul冷的试剂A，置4℃条件下持续轻微振荡5-15分钟。用Dounce匀浆器充分匀浆20-30次。

【注】:

1. 用Dounce匀浆器匀浆至细胞充分破碎，无明显可见固体。
2. 标准Dounce匀浆器用紧杵5-8次，松杵匀浆15-20次。
3. 每上下一个来回为一次。
4. 没有Dounce匀浆器也可用普通玻璃匀浆器或匀浆机匀浆。
5. 普通玻璃匀浆器匀浆一般也不超过30次，匀浆次数并非越多越好。
6. 然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。弃沉淀，收集上清。

【注】:

1. 试剂A处理后，细胞沉淀体积应明显减少。
2. 将上清吸入另一预冷的干净离心管。
3. 在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。弃上清，留沉淀。
4. 在沉淀中加入200ul冷的试剂B，混匀。
5. 在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。弃上清，留沉淀。
6. 在沉淀中加入200ul冷的试剂C，高速涡旋振荡15秒，置4℃条件下持续轻微振荡15-30分钟。

【注】:

1. 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
2. 此步骤必须在4℃条件处理。
3. 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。
4. 提取液C在使用前须一直置于2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
5. 在37℃水浴/气浴10分钟。
6. 在37℃条件下1000-2000×g离心5分钟，此时溶液分为两层(对着光线看)，下层约为20-40ul。

【注】:

1. 必需保证在37℃左右下离心，至少确保30℃以上。
2. 无可控温的离心机时，也可以不离心，稍微延长37℃水浴/气浴时间，至液体澄清，分层清晰即可。
3. 进行下游实验时，可以用试剂D分别稀释上层和下层,取一个上层样品同时进行实验分析。
4. 小心吸取上层丢弃，留下下层溶液。

【注】

1. 移除上层时沿着管壁液面小心吸取，不要搅动下层。
2. 下层为粘稠状液体。
3. 用50-100ul冰冷的膜蛋白溶解液溶解下层，即得线粒体膜蛋白。

【注】:

1. 膜蛋白比较难溶解,不能很快溶解混匀,可以在加入溶解液后稍微吹打混匀,然后置于4℃冰箱静置至溶解。中途用移液器轻轻吹打混匀一次。静置后取出再次用移液器稍微吹打混匀即可。
2. 于4℃静置直至管底透明胶状物完全溶解。
3. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

【注】:

1. 建议用BCA法进行蛋白定量。
2. 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

组织样本：

1. 提取液准备：

每200ul冷的蛋白提取液C中加入1ul蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

每200ul冷的试剂D中加入1ul蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

【注】:

1. 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
2. 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
3. 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
4. 取100mg左右的组织样本，用手术剪刀将组织尽可能剪碎，用PBS缓冲液或生理盐水洗涤干净。

【注】:

1. 由于线粒体膜蛋白含量较少，在条件允许的情况下，需要较多的样本才能保证得率。
2. 加入适量PBS(或400ul冷的试剂A)，用Dounce匀浆器充分匀浆20-30次。

【注】:

1. 用Dounce匀浆器匀浆至细胞充分破碎，无明显可见固体。
2. 标准Dounce匀浆器用紧杵5-8次，松杵匀浆15-20次。
3. 每上下一个来回为一次。
4. 没有Dounce匀浆器也可用普通玻璃匀浆器或匀浆机匀浆。
5. 普通玻璃匀浆器匀浆一般也不超过30次，匀浆次数并非越多越好。
6. 然后将匀浆液在4℃，500×g条件下离心5分钟。
7. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。
8. 将上清在4℃，1000×g条件下离心10分钟，弃沉淀，收集上清。
9. 在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。弃上清，收集沉淀。
10. 在沉淀中加入200ul冷的试剂B，充分混匀。
11. 在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。弃上清，收集沉淀。
12. 在沉淀中加入200ul冷的试剂C，高速涡旋振荡15秒，置4℃条件下持续轻微振荡20-30分钟。

【注】:

1. 使用振荡器/摇床的较低转速，保持液体轻微晃动即可。
2. 此步骤必须在4℃条件处理。
3. 没有振荡条件也可以不振荡，在4℃静置，稍微延长时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
4. 提取液C在使用前须一直置于2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
5. 在37℃水浴/气浴10分钟。
6. 在37℃条件下1000-2000×g离心5分钟，此时溶液分为两层(对着光线看)，下层约为20-40ul。

【注】:

1. 必需保证在37℃左右下离心，至少确保30℃以上。
2. 无可控温的离心机时，不离心，延长37℃水浴/气浴时间至液体澄清透明，分层明显即可。
3. 小心吸取移除上层，留下下层溶液。

【注】

1. 移除上层时沿着管壁液面小心吸取，不要搅动下层。
2. 下层为粘稠状液体。
3. 用50-100ul冰冷的膜蛋白溶解液溶解下层，即得线粒体膜蛋白。

【注】:

1. 膜蛋白比较难溶解,不能很快溶解混匀,可以在加入溶解液后稍微吹打混匀,然后置于4℃冰箱静置至溶解。中途用移液器轻轻吹打混匀一次。静置后取出再次用移液器稍微吹打混匀即可。
2. 于4℃静置直至管底透明胶状物完全溶解。
3. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

【注】:

1. 建议用BCA法进行蛋白定量。
2. 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

常见问题分析：

1. 蛋白浓度低？

处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A和试剂C的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。

线粒体膜蛋白丰度较低，在条件允许的情况下，需要尽可能的加大细胞样本的上样量，才能收获足够的膜蛋白。

1. 用什么方法定量蛋白？

建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂D中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。

1. 提取的蛋白具有活性吗？

本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。

1. 膜蛋白电泳没有条带？

膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。

膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。

蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。

蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%-10%。

有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。

电泳时最好采用低电压低电流电泳。

膜蛋白丰度通常较低，有条件可以尝试用银染染色。

注意事项：

1. 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
2. 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
3. 实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。
4. 免皮肤或粘膜与试剂接触。如果试剂不小心接触皮肤或眼睛，应立即用水冲洗。