血小板膜蛋白提取试剂盒

血小板膜蛋白提取试剂盒说明书

货号: D03600

规格：50T/100T

保存：2-8℃保存，有效期1年。

产品内容：

注：

1. 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2. 蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3. 试剂拆封后请尽快使用完！

产品简介：

血小板膜蛋白提取试剂盒适用于从各种动物血小板中提取膜蛋白。提取过程简单方便，可在1小时内完成。

本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解膜组份。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。

本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。

本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。

本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用其他货号的试剂盒。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用脱盐柱脱盐处理。

自备试剂和仪器：

离心机、振荡器、匀浆机/匀浆器、涡旋混匀器、移液器、冰箱、冰盒，PBS缓冲液、蛋白定量试剂盒，离心管、吸头、一次性手套

产品特点：

1. 使用方便，蛋白提取的时间约1小时。
2. 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
3. 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。

使用方法：

1. 使用注意事项：
2. 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
3. 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
4. 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
5. 操作步骤
6. 提取液准备：

每500μL冷的蛋白提取液A中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

每500μL蛋白溶解液C中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

【注】：

• 1. 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  2. 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
  3. 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。

1. 取1-5mL ACD抗凝血，室温200g离心10分钟。

【注】：

• 1. 离心力在180-220g均可，不要大于250g。
  2. 最好用尽可能新鲜的血样。

1. 收集上层血浆，弃下层血液细胞沉淀。

【注】：

• 1. 如果血浆层与红细胞层之间形成白膜，小心吸取白膜层加入上层血浆。

1. 上层血浆室温3000g离心10分钟，弃上清，收集沉淀。

【注】：

• 1. 如果对血小板低活化程度要求较高，血小板需要进行再培养等处理，此步骤离心力可以降低到2000g，离心时间缩短至5分钟。
  2. 降低离心力和缩短离心时间会降低蛋白回收率。

1. 沉淀中加入500μL提取液B洗涤一次，3000g离心10分钟，弃上清，收集沉淀。
2. 沉淀中加入300-500μL冷的蛋白提取液A，充分混匀后，在4℃条件下振荡20-30分钟。

【注】：

• 1. 必须在2-8℃条件下振荡。
  2. 用振荡器/摇床的较低转速，保持液体有轻微晃动即可。
  3. 没有振荡条件可以不振荡，2-8℃静置，稍微延长处理时间即可，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。

1. 在4℃，12000g条件下离心10分钟，取上清。
2. 在37℃水浴10分钟。
3. 在37℃，1000g离心3分钟。

【注】：

• 1. 此步骤必须37℃条件下离心。
  2. 如果离心机不可控温，可以不离心，延长上一步骤水浴时间，至溶液澄清，分层清晰即可。
  3. 或者在室温条件下离心，缩短离心时间至1分钟。

1. 此时液体分为2层，小心移除上层溶液，留管底部的下层，大约30-50μL液体。

【注】：

• 1. 下层为粘稠状液体。

1. 用1-2倍体积的膜蛋白溶解液C溶解该液体，即得血小板膜蛋白样品。
2. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

【注】：

• 1. 建议用BCA法进行蛋白定量。
  2. 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

常见问题：

①蛋白浓度低？

血小板膜蛋白丰度较低，在条件允许的情况下，需要尽可能加大血小板的上样量。

处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。

②用什么方法定量蛋白？

建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。

③提取的蛋白具有活性吗？

本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。

④膜蛋白电泳没有条带？

膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。

膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。

蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。

蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%-10%。

有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。

电泳时最后采用低电压低电流电泳。

注意事项：

1. 正式实验前请选取几个样本做预实验，以优化实验条件，取得最佳实验效果。
2. 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
3. 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
4. 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
5. 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
6. 实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。