Ribonuclease R (RNase R)
产品组成：
货号 | 试剂 | 规格 | 保存条件 |
E21990 | RNase R (20U/μL) | 500 U | -20℃（干冰运输） |
10X Reaction Buffer | 1 mL |
产品说明：
RNase R (Ribonuclease R)是一种来源于大肠杆菌RNR超家族的3’-5’核糖核酸外切酶，可从3’-5’方向将RNA逐步切割成二核苷酸和三核苷酸。RNase R可消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化环形RNA、套索结构或3’突出末端少于7个核苷酸的双链RNA分子。RNase R常用于基因表达和可变剪切研究，可消化线性RNA以使环形RNA (circRNAs)或套索结构RNA (lariat RNA)得到富集。
单位定义：
标准反应体系下，于 37℃，10 min 将 1 μg poly-r(A)转化成酸溶性的核苷酸所需的酶量定义为一个活力单位(U)。
注意事项：
1）RNase R 在 0.1-0.5 mM Mg2+存在时活性最高，反应中 EDTA 可能降低 RNase R 活性，此时可额外添加 MgCl2 使 Mg2+ 浓度最高达到 0.5 mM。
2）孵育后可于 70℃，10 min 使酶失活，再进行下游实验（如逆转录）；也可不灭活，直接纯化后进行下游实验。
质量控制：
SDS-PAGE 检测纯度>99%；Total RNA 经 RNase R 消化后进行 RT-qPCR 检测，线性 RNA 丰度明显降低，环形RNA 丰度基本不变。
RNase R消化实验 ：
1 反应体系
表 1 推荐的 RNase R 消化体系
RNA | < 5 μg | > 5 μg |
10X Reaction Buffer | 2 μL | 5 μL |
RNase R（20U/μL）* | 1-3 U/μg RNA | 1-3 U/μg RNA |
RNase-Free Water * | Up to 20 μL | Up to 50 μL |
*：RNase R用量和反应体系总积 用量和反应体系总积 需要根据实验进行调整 。
反应时间:37℃孵育 15 min。
反应终止:70℃加热 10 min。
2 纯化回收
消化后的RNA可使用苯酚：氯仿异戊醇（25: 24:1）溶液抽提，再使用乙醇沉淀回收；或者用 RNA纯化柱或磁珠进行纯化回收。经 RNase R消化后直接进行RT-PCR的， 一般可以不做纯化的，保持 70℃，10 min使酶失活后直接进行逆转录反应即可。
注：苯酚氯仿异戊醇（25: 24:1）溶液最好现配用，没有试剂也可以 Trizol Reagent代替。
常见问题：
1 消化时间的选择
一般10-30 min即可消化掉大部分线性RNA，PCR检测线性RNA丰度有几百倍的降低，也可按需求适当延长消化时间，但不推荐1h以上的消化，因为时间过长可能导致少数耐受力弱的 ，因为时circRNAs被消化。
2 内参的选择
RNase R消化后不能再使用β-actin或 GAPDH作为内参，因此可以将原始的RNA等分为两份，一份进行RNase R处理（ RNase R+），另一份不处理（RNase R- ），统一以RNase R- 组中的内参为计算标准。
如果在RNase R消化后进行纯化回收，则RNA浓度/总量可能有变化，导致测量浓度过低或不准确，不适宜再以RNase R- 组的内参作为计算标准，此时可在纯化回收前加入少量其他物种的RNA作为外参，统一以外参标准化样品后进行计算。
3 实验结果一致性（重复性）差
1) 加样不准确。RNA或RNase R的用量有偏差，导致内参不齐或者消化程度不一致。在同一对比实验中，除了是否加RNase R外，应确保其他所有条件一致。
2) 两次重复实验结果不一致。尽量同时进行RNase R+ 和RNase R- 组的消化实验，使用相同的反应条件，PCR检测使用同样的条件和引物等。
4 消化不成功
1) 检测mRNAs和circRNAs丰度都没有明显变化。可能是因为RNase R消化反应体系、PCR检测等有误。实验中应使用配套的10X Reaction Buffer配置反应液，可以尝试调整反应体系和条件，额外添加MgCl2（Mg2+ 终浓度最高0.5 mM）也可以增强反应中RNase R的活性。建议RNase R消化后先取部分进行电泳检测，确认28/18/5S条带变淡或不可见，否则可能是未成功消化。
2) RNase R+ 组中检测不到circRNAs。可能由于circRNAs丰度过低未能检测到，或者RNA被外源RNase降解。实验中应使用RNase-Free（DEPC处理）的枪头、离心管和水等耗材试剂。
3) RNase R+ 组中circRNAs丰度有明显降低。除了考虑被外源RNase降解外，也有发现少数circRNAs耐受RNase R消化力弱的，提示检测的circRNAs可能被消化，可以尝试减少RNase R用量或缩短消化时间。PCR检测应使用高特异性的引物，注意区分circRNAs和mRNAs可能有的同源序列。
4) 线性RNA消化不完全。限定反应体系和时间时线性RNA不太可能被彻底消化，但应能检测到线性RNA丰度明显降低。某些没有3’突出末端的结构化线性RNA（如snRNAs, snoRNAs, Y RNAs）或含有G-四联体（G-quadruplex）的线性RNA可能耐受RNase R消化，可以尝试以RPAD（high-purity circular RNA isolation method）或组合A-Tailing/LiCl-buffer RNase R消化方法进行调整优化。