钙离子荧光探针Rhod-2 AM

钙离子荧光探针Rhod-2 AM说明书

货号：E22960

规格：1mg

CAS：145037-81-6

分子量：1123.96

溶剂：DMSO

Ex/Em：553/577 nm

保存：-20℃，干燥避光保存，有效期一年。

产品简介:

钙离子荧光探针Rhod-2,AM是一种用于钙通量测定的试剂，钙通量测定是用于筛选G蛋白偶联受体（GPCR）的药物发现中的优选方法。

适用仪器

荧光显微镜

Ex：TRITC滤波片组

Em：TRITC滤波片组

推荐孔板：黑色透明底板

荧光酶标仪

Ex：540 nm

Em：590 nm

Cutoff：570 nm

推荐孔板：黑色透明底板

读取模式：底读模式/可分液处理

操作步骤(仅供参考)

1. 使用钙指示剂AM Esters加载细胞：

AM酯是非极性酯，其易于穿过活细胞膜，并且通过活细胞内的细胞酯酶快速水解。AM酯广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。但是，使用AM酯时必须小心，因为它们易于水解，特别是在溶液中。它们应该用高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）重新配制。DMSO储备溶液应在-20°C下干燥储存并避光。在这些条件下，AM酯应稳定数月。

以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。该方案仅提供指南，实际应根据您的具体需求进行修改。

1. 在高质量无水DMSO中制备2~5mM AM酯原液。
2. 在实验当天，将钙指示剂溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。使用0.02％ Pluronic F-127在您选择的缓冲液（如Hanks和Hepes缓冲液）中制备1~10μM的工作溶液。对于大多数细胞系，我们建议钙指示剂的终浓度为4-5μM。细胞加载所需指标的确切浓度必须根据经验确定。为避免因过载和潜在染料毒性引起的任何伪影，建议使用可产生足够信号强度的小探针浓度。
3. 如果您的细胞含有有机阴离子转运蛋白，可以在细胞培养基中加入丙磺舒（1-2.5mM）或磺吡酮（0.1-0.25mM），以减少脱酯化指标的泄漏。在室温或37℃下用钙指示剂酯孵育细胞20分钟至1小时。
4. 在HHBS或您选择的缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如2.5mM丙磺舒，如果适用）中洗涤细胞1-2次以除去过量的探针。
5. 在所需的Ex/Em波长下进行实验。
6. 测量细胞内钙响应：

为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的Kd，使用等式：[Ca]_free=K_d[F-F_min]/F_max-F]

其中F是实验钙水平下指示剂的荧光，F_min是不存在钙时的荧光，F_max是钙饱和探针的荧光。解离常数（K_d）是探针对钙的亲和力的量度。与校准溶液相比，荧光指示剂的Ca²⁺结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显著。细胞内指标的原位校准通常产生显着高于体外测定的K_d值。通过在离子载体如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素存在下将加载的细胞暴露于受控的Ca²⁺缓冲液来进行原位校准。或者，细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露于细胞外培养基的受控Ca²⁺水平。

注意：*标记的条件因细胞种类而异，在每次实验前，请先确定最佳条件。以上方法仅供参考。

注意事项：

1. 体积可根据需要和实验装置的体积进行调整。
2. 对于含有阴离子通道蛋白的细胞，可在染料工作液中可加入有机阴离子转运抑制剂probenecid（0.5-1.0mM），以减少指示剂去酯后的渗漏。
3. 细胞加载所需指标的确切浓度必须根据经验确定。为避免因过载和潜在染料毒性引起的任何伪影，建议使用可产生足够信号强度的小探针浓度。
4. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
5. 产品信息仅供参考。本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。
6. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。