5×One Step RT Premix（Probe qRT-PCR）
货号：M00570
规格：50T
保存：-20℃保存长期保存，使用前应混匀，避免反复冻融。
产品内容：
25×One Step RTase mix
5×One Step RT Mix Buffer
产品介绍：
One Step RT Premix （qRT-PCR Probe）是一步法（One Step）RT PCR荧光定量探针法定性、定量反应的专用试剂，反应过程在同一管内连续进行，避免开管，能有效防止污染。本品含有高温反转录酶（RNase H-）和新型热启动酶，具有更高的反转录和PCR扩增效率，适合于低浓度RNA模板的高灵敏度扩增。本试剂采用优化配方的专用Buffer，可以在较宽的定量区域内得到良好的标准曲线，准确进行定量，并与多数厂家的荧光定量PCR仪兼容，如Applied Biosystems、Eppendorf、Bio-Rad和Roche等。
试剂原理：
One Step RT Premix首先利用反转录酶RTase将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板通过热启动DNA扩增酶在单管闭管反应体系中连续进行PCR扩增反应，利用荧光标记探针（Probe）水解发光，并对发光信号进行检测。
- RT-PCR
首先采用反转录酶以RNA为模板合成 cDNA，然后再以合成的cDNA为模板，经过PCR扩增反应的热变性、引物退火、链延伸三个步骤循环往复，在短时间内扩增得到大量DNA片段。
- 荧光检出
TaqMan探针法是使用5’端带有荧光物质，3’端带有淬灭物质的TaqMan 探针进行荧光检测的方法。在探针没有被Taq酶分解时，5’端的荧光物质受到3’端淬灭物质的制约，不能发出荧光。而当TaqMan探针被分解后，5’端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。在PCR反应液中加入荧光探针后的退火过程中，荧光探针便会和模板配对区域结合。在PCR反应的延伸过程中，Taq DNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性可以分解和模板杂交的荧光探针，游离出的荧光物质便会发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度，可以达到检测PCR产物扩增量的目的。
反应条件：
（1）PCR程序（两步法）
反转录：50℃ 20分钟；
变 性：95℃ 3分钟；
变 性：95℃ 10~20秒；
35~50个循环
退火/延伸：60℃ 20~60秒。
2、PCR程序（三步法）
反转录：50℃ 20分钟；
变 性：95℃ 3分钟；
变 性：95℃ 10~20秒；
退 火: 56-64℃ 10~30秒；
35~50个循环
延 伸：72℃ 10~60秒。
RT PCR反应体系配制：
试剂 | 25μl体系 | 50μl体系 | 终浓度 |
25×One Step RTase mix | 1 | 2 | 1× |
5×One Step RT Premix Buffer | 5 | 10 | 1× |
Primer 1（10μM） | 0.5-2.5μl | 1-5μl | 0.2~1.0μM |
Primer 2（10μM） | 0.5-2.5μl | 1-5μl | 0.2~1.0μM |
TaqMan Probe | - | - | 0.1~0.5μM |
RNA | - | - | - |
ddH2O | - | - | - |
Total volume | 25μl | 50μl |
- 通常引物终浓度为0.2μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0μM范围内调整引物浓度；
- 通常探针浓度可在0.1～0.3μM范围内优化。可进行浓度梯度的实验，寻找引物和探针的最佳组合。探针的使用与Real Time PCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，请参照仪器说明书或各荧光探针的具体使用要求进行；
- 不同种类的模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的模板添加量。
质量控制：
- 功能检测：qPCR的敏感性、特异性、可重复性；
- 无外源核酸酶活性，无外源内切、外切核酸酶污染。
技术说明：
- 该体系常用50℃进行反转录反应，可以在45℃~60℃范围内进行反转录温度优化；根据反应特征不同，可以在5~30分钟内对反转录时间进行优化；
- 该体系所用的反转录酶是在MMLV基础上进行了基因改造，去除了RNaseH活性，使其具有更高的温度耐受性和反转录温度，对RNA复杂结构模板具有更高的反转录效率；
- 该体系具有更好的体系稳定性和适用性，非常适合于病毒类、组织提取RNA复杂模板的检测；对极限浓度模板的扩增效果更加稳定。