SuperRT一步法PCR试剂盒说明书
货号：M00580
规格：100T
英文名称：SuperRT One Step RT-PCR Kit
保存：-20℃，1年
产品内容：
Component | 100 T |
SuperRT OneStep EnzymeMix | 50 μl |
2 ×SuperRT OneStep Buffer | 1.4 ml |
RNase-Free Water | 1.5 ml |
产品说明（仅供参考）:
该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。
本试剂盒是专为一步法RT-PCR实验研制，逆转录和PCR在同一反应体系中进行， 反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，在避免污染的同时提高了检测灵敏度和实验 效率。本试剂盒包括全新高效逆转录酶、快速热启动DNA聚合酶，同时包含适用于逆转 录和PCR扩增的反应缓冲液和实验中所必需的其它组分。 SuperRT逆转录酶RNase H活 性缺失，减少了逆转录反应中RNA的降解。该逆转酶逆转录效率高，可对少量RNA模 板进行良好的逆转录反应。 PCR反应使用的快速热启动DNA聚合酶具有扩增效率高、 特异性强、延伸速度快的优良性能。独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大 功效。使用本试剂盒扩增得到的目的产物3′端附有一个″A″碱基，可直接用于T/A克隆。
注意事项
1 ．在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门 的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套。
2 ．实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙 酯）水溶液在37℃处理12小时，并在120℃下高压灭菌30分钟后使用，或者将玻璃 器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用0.1%的DEPC 处理后进行高压灭菌。
3 ．本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃,避免反复冻融。
4 ．本试剂盒必须使用特异性引物，引物的选择可根据具体实验来选择，引物设计的好坏直接影响到RT-PCR 反应的结果，设计引物时需考虑GC含量，引物长度，引物 位置， PCR产物的二级结构等因素，建议采用专业的引物设计软件来设计。
使用方法
1 ．将RNA模板、引物、 OneStep RT-PCR Buffer、SuperRT OneStep RT-PCR
EnzymeMix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2 ．根据以下表格配制反应体系：
试剂 | 25 μl反应体系 | 终浓度 |
2×SuperRT OneStep Buffer | 12.5 μl | 1× |
Forward Primer，10 µM | 1 μl | 0.4 μM |
Reverse Primer，10 µM | 1 μl | 0.4 μM |
SuperRT OneStep EnzymeMix | 0.5 μl | |
RNA Template | X μl | 1 pg – 1 µg |
RNase-Free Water | up to 25 μl |
注意：引物浓度请以终浓度0.1-1.0 μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引 物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。
3 ．涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。
4 ．将热循环仪预热到45℃,将PCR管置于热循环仪中，进行RT-PCR反应。 反应条件：
步骤 | 温度 | 时间 |
反转录 | 45℃ | 30 min |
PCR预变性 | 95℃ | 2 min |
变性 | 94℃ | 30 s 30-40个循环 |
退火 | 55-65℃ | 30 s |
延伸 | 72℃ | 30 s |
终延伸 | 72℃ | 5 min |
注意：
1 ）一般PCR实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5 ℃,退火时间一般为20-30秒， 无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
2 ）延伸时间根据扩增的片段大小设定，本产品中包含的DNA Polymerase扩增效率为1 kb/30s。
3 ）可根据扩增产物的下游应用设定循环数。循环次数太少，扩增量不足；循环次数多，错配机 率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。
5．反应结束后取5 µl反应产物，加入适量上样缓冲液后进行电泳检测结果。