探针法检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的专用预混液说明书
货号: M00650
规格：5mL
英文名称：Animal Detection Probe Mixture (UNG)
保存：-20℃，如需频繁使用，可存放于2-8℃，尽量避免反复冻融
产品内容：
Component | 5 mL |
2×Animal Detection Probe Mixture (UNG) ddH 2O | 5×1 mL 5×1 mL |
产品简介
Animal Detection Probe Mixture (UNG)是一款适用于探针法检测非洲猪瘟病毒 (ASFV)的专用预混液，浓度为2×,包含新型抗体修饰的Taq DNA聚合酶、PCR Buffer、dNTPs、Mg2+ 以及增强剂和稳定剂，使用方便快捷。该产品可以兼容单重与多 重探针法qPCR反应体系，同时也可用于基因组DNA靶序列和RNA反转录后的cDNA靶序列检测。
本产品中运用了dUTP-UNG防污染系统，在PCR反应体系配制过程中加入了dUTP，因此就形成了含有dU碱基的扩增产物。而此产物可以在下次进行PCR反应 前，由PCR体系中的UNG酶处理消除。这样就有效的去除了PCR 产物的残留污染，大大降低了由于扩增产物污染而导致的假阳性。 UNG酶在PCR循环中的预变性步骤即可 被灭活，因此不会影响新的含dU碱基PCR产物的形成。
本品含有抗体修饰的高灵敏度工程DNA聚合酶，能在有效减少常温条件下由引物 和模板非特异性结合或引物二聚体而产生的非特异性扩增的同时，大幅提升检测灵敏度和扩增效率，酶的激活仅需在95℃孵育30 s，大大缩短了PCR的反应时间。精心优化的PCR缓冲体系，有效抑制了非特异产物的产生，能够显著提高PCR的扩增效率，灵敏度更高。
注意事项
使用前请在本品完全融化后上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。避免反复冻融本品，反复冻融可能使产品性能下降。本产品长期保存可置于-20℃避光保存。如果在短期内需要频繁使用，可在2-8℃保存。ROX染料用于校正定量PCR孔间产生的荧光信号误差，本品中不含ROX染料，如所使用仪器需匹配ROX染料,请联系当地业务。
PCR反应体系
试剂 | 50 μl体系 | 25 μl体系 | 终浓度 | |
2×Animal Detection Probe mixture (UNG) | 25 μL | 12.5 μL | 1× | |
Forward Primer ，10 μM | 1 μL | 0.5 μL | 0.2 μM1) | |
Reverse Primer ，10 μM | 1 μL | 0.5 μL | 0.2 μM | |
Probe2) | 1 μL | 0.5 μL | 0.2 μM | |
Template DNA3) | X μL | X μL | ||
50×ROX reference dye（optional）4） | 1 | 0.5 | 1× | |
ddH O 2 | Up to 50 μL | Up to 25 μL | ||
注意： 1）通常引物终浓度以0.2 μM可以得到较好结果，可以在0.1-1.0 μM作为设定范围的参考。扩增效率不 高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。 2）所用探针的终浓度，与使用的荧光定量PCR仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参 照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。 3）通常DNA模板的量以10-100 ng基因组DNA或1-10 ng cDNA为参照，因不同物种的模板中含有的目 的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。 4）不同仪器的激发光学系统有所不同，根据使用荧光定量的仪器选择加入50×Low ROX or 50×High ROX。不同机型ROX reference dye使用情况参考下表。 | ||||
无需添加ROX校正的仪器 | Roche LightCycler 480 ，Roche LightCyler 96， Bio-rad iCyler iQ ，iQ5 ，CFX96等 | |||
需要Low ROX校正的仪器 | ABI Prism7500/7500 Fast ，QuantStudio® 3 System， QuantStudio® 5 System ， QuantStudio® 6 Flex System， QuantStudio® 7 Flex System ，ViiA 7 system， Stratagene Mx3000/Mx3005P， Corbett Rotor Gene 3000等 | |||
需添加High ROX校正的仪器 | ABI Prism7000/7300/7700/7900 ，Eppendorf， ABI Step One/Step One Plus等。 | |||
PCR反应体系
步骤 | 温度 | 时间 | 循环 |
UNG消化 | 50℃ | 2 min | 1 |
预变性 | 95℃ | 30 s1) | 1 |
变性 | 95℃ | 10 s | 45 |
退火/延伸 | 60℃ | 20 s2) |
注意：
1) 本产品所采用的酶在预变性95℃、30 s条件下实现酶的活化。在此条件下，大多数模板可良好的进行 解链。对GC含量高、二级结构复杂的模板，可将预变性时间延长至1min，以使起始模板充分解链，若高 温处理时间过长，会对酶的活性造成影响；对于简单模板也可采用预变性20 s，可根据模板情况确定最佳 的预变性时间。
2）建议采用两步法PCR反应程序，退火温度请以58-64℃作为设定范围的参考，发生非特异性反应时， 可提高退火温度。若因使用Tm值较低的引物或者扩增产物过长等原因， 得不到良好的实验结果时，可尝 试进行三步法PCR扩增，退火温度请以56℃-64℃的范围作为设定参考。
几种常见仪器的退火延伸时间设定如下：
使用Roche，BioRad、Agilent和宏石、东胜等公司荧光定量PCR仪时请设定在20 s。
使用ABI 7000/7300/7500时请设定在30 s。
退火/延伸时间可根据使用不同型号仪器和不同模板进行设定，请按照仪器使用说明书要求进行实验操作。