GoldStar Probe One Step RT-qPCR Kit说明书
货号: M00800
规格：5mL
别名：金牌探针法一步法RT-qPCR mix
保存：-20℃避光保存。如需频繁使用，可存放于2-8℃,尽量避免反复冻融。
产品内容：
Component | RE1277 | Low ROX | 50×High ROX |
2×GoldStar Probe One Step Buffer | 1.4 ml | 1.4 ml | 1.4 ml |
GoldStar Probe One Step EnzymeMix | 100 μl | 100 μl | 100 μl |
50×Low ROX | - | 50 μl | - |
50×High ROX | - | - | 50 μl |
RNase-Free Water | 1.5 ml | 1.5 ml | 1.5 ml |
产品简介
本产品是采用探针法（TaqMan，Molecular Beacon等）进行一步法Real-Time RT- qPCR的专用试剂盒。使用本产品进行Real Time RT-qPCR反应时，逆转录和定量PCR 在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，避免了污染的同时提高了实验效率。本产品的检测灵敏度高，荧光信号强，信噪比高，非常适合于 RNA病毒等微量RNA的检测。其所包含的特殊缓冲系统能使逆转录酶与DNA聚合酶同时发挥最大功效，提高反应效率。使用本产品可以得到更宽广的线性范围，对目的基因定量更准确，重复性好，可信度高。
ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差， 一般用于ABI 、 Stratagene等公司的Real Time PCR 扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同，因此 ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
不需要ROX校正的仪器:
Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-rad iCyler iQ，iQ5，CFX96等。
需要Low ROX校正的仪器：
ABI Prism7500/7500 Fast ，QuantStudio® 3 System ，QuantStudio® 5 System， QuantStudio® 6 Flex System ，QuantStudio® 7 Flex System ，ViiA 7 system， Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
需要High ROX校正的仪器：
ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。
注意事项
- 本试剂盒中试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
- 本产品以RNA为模板进行一步法RT-PCR实验，在操作过程中应避免RNase污染，建议在专门的区域进行RNA操作， 使用专门的仪器和耗材， 操作人员带口罩和一次 性手套并经常更换手套，实验相关耗材应用0.1％DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在 37 ℃处理12小时,并高压灭菌30分钟后使用。
3．本试剂盒中的各试剂应尽量避免反复冻融，反复冻融可能使产品性能下降。
4．本试剂盒必须使用特异性引物，引物的选择可根据具体实验来选择，引物设计的好 坏直接影响到RT-qPCR反应的结果，设计引物时需考虑GC含量，引物长度，引物位置， PCR产物的二级结构等因素，建议采用专业的引物设计软件进行设计。
5．本试剂盒推荐使用特异性探针，建议采用专业的设计软件进行设计。
使用方法
以下举例为常规的反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片 段大小的不同进行相应的改进和优化。（反应液的配置请在冰上进行）
1．将RNA模板、引物、2×GoldStar Probe One Step Buffer 、GoldStar Probe OneStep EnzymeMix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2．PCR反应体系：
试剂 | 25 μl反应体系 | 终浓度 |
2×GoldStar Probe One Step Buffer | 12.5 μl | 1× |
Forward Primer，10 µM | 0.5 μl | 0.2 μM 1） |
Reverse Primer，10 µM | 0.5 μl | 0.2 μM 1） |
Probe ，10 µM | 0.5 μl | 0.2 μM 2） |
GoldStar Probe One Step EnzymeMix | 1.0 μl | |
RNA Template | X μl | 10 pg – 100 ng3） |
50×Low ROX or High ROX （optional）4） | 0.5 μl | 1× |
RNase-Free Water | up to 25 μl |
注意：
- 通常引物浓度以0.2 μM可以得到较好结果，可以在0.1-1.0 μM作为设定范围的参考。
- 使用的探针浓度，与使用的荧光定量PCR仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。
3）通常RNA模板的量以10 pg – 100 ng为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不 同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。
4）不同仪器的激发光学系统有所不同，根据使用荧光定量的仪器选择加入50×Low ROX or 50× High ROX。
3．混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。
4．RT-PCR反应条件：
步骤 | 温度 | 时间 |
逆转录 | 45℃ | 10 min |
PCR预变性 | 95℃ | 10 min1） |
变性 | 95℃ | 15 s 30-40个循环 |
退火/延伸2） | 60℃ | 45 s |
注意：
1）本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、 5-10 min条件下实现酶的活化。
2）建议采用两步法PCR反应程序，若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果 时，可尝试进行三步法PCR扩增，退火温度请以 56℃-64℃的范围作为设定参考。