miRNA cDNA Synthesis Kit说明书
货号: M00820
规格：25T
别名：miRNA逆转录试剂盒
保存：-20℃
产品内容：
Component | 25 T |
Tris-HCl ，1 mM ，PH8.0 | 1 ml |
E. coli Poly(A) Polymerase ，5U/μl | 15 μl |
10×Poly(A) Polymerase Buffer | 80 μl |
ATP ，10 mM | 15 μl |
RT Primer，25 μM | 90 μl |
5×SuperRT Buffer | 120 μl |
UltraPure dNTP Mix，10 mM each | 30 μl |
SuperRT ，200 U/μl | 15 μl |
RNase-Free Water | 1 ml |
产品简介
本试剂盒采用在miRNA 3’末端加多聚A尾的方法来使miRNA具有Poly(A)尾，之后 再使用Oligo(dT)-Universal tag通用逆转录引物进行逆转录反应，最终合成miRNA对应 的第一链cDNA。
miRNA cDNA第一链合成试剂盒包含miRNA 3’末端Poly(A)尾修饰过程及修饰后逆 转录过程需要的全部试剂。该试剂盒具有非常高的Poly(A)修饰和逆转录效率，可以从 1 ng-2 μg的total RNA中有效获得miRNA对应的cDNA第一链。并且操作简便、快捷， 可以用于从一个反应合成的cDNA中同时检测多种miRNA，不仅减少了误差、节约了样 品，同时还实现了检测的高通量。
备注： 本试剂盒须与miRNA荧光定量检测试剂盒配套使用。
自备实验材料： 1 ng-2 μg的总 RNA，或0.1 ng-1 μg的小分子RNA
注意事项
预防RNase污染，应注意以下几方面：
1．使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
2．玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡 10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。
3．配制溶液应使用无RNase的水。
4．操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
使用方法
A．miRNA加Poly(A)尾的过程：
1．首先根据所用RNA的量，按如下公式，用1 mM Tris（PH8.0）来稀释10 mM ATP： ATP稀释系数=5000/__ng的总RNA
例： 如果总RNA的起始用量为100 ng，那么ATP稀释系数=5000/100=50。即将ATP
稀释50倍（1 μl的10 mM ATP加49 μl的1 mM Tris ，PH8.0）。
2．向冰浴中预冷的无RNase反应管中加入以下试剂至总体积25 μl。
试剂 | 25 μl反应体系 | 终浓度 |
total RNA* | X μl | 可达2 μg |
10×Poly(A) Polymerase Buffer | 2.5 μl | 1× |
第“ 1”步中稀释好的ATP | 1 μl |
|
E. coli Poly(A) Polymerase, 5U/μl | 0.5 μl | 2.5 U |
RNase-Free Water | up to 25 μl |
|
*反应中使用的total RNA必须含有小分子RNA。
此过程也可以直接使用小分子RNA（建议加入量为2-5 μl。请根据目的miRNA的丰 度来确定加入量）。
3．轻轻混匀上述反应液，短暂离心将液体收集于管底。 37℃,孵育15分钟。此过程结 束后，立刻进行第一链cDNA的合成，或于-20℃暂存。如需长期保存，建议存放于 -80℃。
B．修饰后的miRNA cDNA第一链合成的过程：
1．向冰浴中预冷的无RNase反应管中加入下表中试剂，至终体积20 μl：
试剂 | 20 μl反应体系 |
上述Poly(A)反应液 | 4 μl |
UltraPure dNTP Mix ，10 mM each | 1 μl |
RT Primer ，25 μM | 3 μl |
5×SuperRT Buffer | 4 μl |
SuperRT ，200 U/μl | 0.5 μl |
RNase-Free Water | 7.5 μl |
2．轻轻混匀上述反应液，短暂离心将液体收集于管底。 42℃,孵育50分钟。
3．85℃,孵育5分钟，终止反应。合成的cDNA反应液可以直接进行荧光定量检测实验，也可以于-20℃保存备用。