miRNA qPCRAssay Kit说明书
货号: M00830
规格：125T
别名：miRNA qPCR试剂盒
保存：-20℃
产品内容：
Component | 125 rxns |
2×miRNA qPCR Mixture（ ROX ） | 2×750 μl |
Reverse Primer ，10 μM | 60 μl |
ddH2O | 1.5 ml |
产品简介
本试剂盒采用SYBR Green I嵌合荧光染料法的原理来进行miRNA荧光定量PCR检 测。试剂盒包括检测所需的2×miRNA qPCR Mixture和Reverse Primer。2×miRNA qPCR Mixture是专门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧 光定量PCR检测试剂，所含的荧光染料SYBR Green I可以与所有的双链DNA结合，使 该产品可用于不同靶序列的检测而不需合成特异性标记探针。其中的GoldStarTaq DNA polymerase是经化学修饰的高效热启动酶， 配合独特的缓冲体系， 使反应特异性更好， 灵敏度更高，并能在更广的范围内对miRNA进行准确定量。 2×miRNA qPCR Mixture含 有ROX染料， 适用于需要ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪。
备注： 本试剂盒须与miRNA cDNA第一链合成试剂盒（ RE1261 ）配套使用
自备实验材料： qPCR上游引物（Forward primer）
Forward Primer设计原则
1．遵循引物设计的最普遍原则。
2．以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T，这是最基础和最简单的设计方法。
3．试剂盒中提供的下游引物的Tm值为63.6℃,设计上游引物的Tm值要尽量保证在 63.6℃左右。
4．若按照原则“2”的方式直接设计的引物其Tm值过低，可以在引物的5’端添加几个碱 基（最好为G或C碱基）；也可以在3’端添加1个或几个A碱基；或者5’端和3’端同时修饰。
5．若按照原则“2”的方式直接设计的引物其Tm值过高，可以在引物的5’或3’端去掉几个碱基。
注意事项
- 试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
- miRNA 第一链cDNA 的加入量不要超过Real time PCR 体积10%。
3．对于特殊的检测体系，高含量的cDNA模板易导致非特异性扩增，根据所检测miRNA 的丰度适当的稀释cDNA（稀释10倍或者100倍）。
4．本产品中的2×miRNA qPCR Mixture中含有SYBR Green I和ROX染料，保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
5．避免反复冻融本品，反复冻融可能使产品性能下降，本产品长期保存可置于-20℃。 如果在短期内需要频繁使用， 2×miRNA qPCR Mixture可于2-8℃保存。而Reverse primer仍需置于-20℃保存。
操作步骤
1．室温融化2×miRNA qPCR Mixture和Reverse primer（10 μM）。
2．使用时请将2×miRNA qPCR Mixture上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经短暂离
心后使用。如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。
3．将试剂置于冰上，并按下表配制反应体系：
试剂 | 体积 | 终浓度 |
2×miRNA qPCR Mixture（ROX） | 10 μl | 1× |
Forward primer（10 μM） | 0.4μl | 0.2 μM |
Reverse primer（10 μM） | 0.4μl | 0.2 μM |
miRNA第一链cDNA | X μl | — |
ddH2O | up to 20 μl | — |
4 ．反应程序设置如下：
注意！本产品预变性反应必须在95℃ 10分钟下完成！
步骤 | 温度 | 时间 | |
预变性 | 95℃ | 10min1） | |
变性 | 95℃ | 15s | 40-45个循环 |
退火/延伸 | 60℃ | 1min | |
溶解曲线分析 | 根据PCR仪要求设定 |
注意：
1）本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、10 min条件下实现酶的活化。
2）退火温度请以60-64℃作为设定范围的参考，发生非特异性反应时，可提高退火温度。