SuperFast Probe One Step RT-qPCR U+ Kit说明书
货号: M00870
规格：200 rxns
别名：快速一步法检测试剂盒
保存： -30℃--15℃保存， ≤0℃运输
产品内容：
Component | RE1279 200 rxns |
5×SuperFast One Step RT-qPCR U+ Buffer | 1 mL |
SuperFast One Step U+ Enzyme | 200 μL |
RNase-Free Water | 2×1.5 mL |
产品简介
SuperFast Probe One Step RT-qPCR U+ Kit专为以RNA为模板(如RNA病毒)的定量PCR检测而设计。使用基因特异性引物(GSP)，逆转录和qPCR反应在一管内完成，不需要额外的开管/移 液操作，大大提高了检测通量，并降低了污染的风险。本试剂盒中引入了dUTP/UNG防污染系 统。热敏感UNG在室温下即可将含U的污染物迅速降解； 55℃逆转录时迅速失活，不会影响 qRT-PCR的效率和灵敏度。配合经过优化的缓冲体系和抗体修饰Taq酶以及突变后的M-MLV ， SuperFast Probe One Step RT-qPCR U+ Kit的检测灵敏度可达到0.1pg总RNA或<10拷贝的RNA 模板且具有更高的热稳定性。 5×SuperFast One Step RT-qPCR U+ Buffer包含优化的缓冲体系和 dNTP/dUTP Mix，尤其适用于TaqMan等荧光标记探针的高特异性、低模板浓度和多重快速检测。
注意事项
使用前请在本品完全融化后上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。避免反复冻融本品。 ROX染料用于校正定量PCR孔间产生的荧光信号误差，本品中不含ROX染料，如所使用仪器需匹配ROX染料，请联系当地业务。
PCR反应体系
试剂 | 50 μL体系 | 25 μL体系 | 终浓度 |
5×SuperFast One Step RT-qPCR U+ Buffer | 10 μL | 5 μL | 1× |
SuperFast One Step U+ Enzyme | 2 μL | 1 μL | |
Forward Primer ，10 μM | 1 μL | 0.5 μL | 0.2 μM1) |
Reverse Primer ，10 μM | 1 μL | 0.5 μL | 0.2 μM |
Probe2) | 0.5 μL | 0.25 μL | 0.1 μM |
Template RNA3) | X μL | X μL | |
RNase-Free Water | Up to 50 μL | Up to 25 μL |
注意：
1）通常引物终浓度以0.2μM可以得到较好结果，可以在0.1-1.0μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情 况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。
2）所用探针的终浓度，与使用的荧光定量PCR仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪 器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。
3）因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。
PCR反应条件
步骤 | 温度 | 时间 | 循环 |
逆转录 | 55℃ | 1 min | 1 |
预变性 | 95℃ | 10s1) | 1 |
变性 退火/延伸 | 95℃ 55-60℃2) | 1 s 10-15s3) | 40-45  |
注意：
1）本产品所采用的酶在预变性95℃,30s条件下实现酶的活化。在此条件下，大多数模板可良好的进行解 链。对GC含量高、二级结构复杂的模板，可将预变性时间延长至1min，以使起始模板充分解链，若高温处 理时间过长，会对酶的活性造成影响；对于简单模板也可采用预变性1-10s，可根据模板情况确定最佳的预 变性时间。
2）建议采用两步法PCR反应程序，退火温度请以55-60℃作为设定范围的参考，发生非特异性反应时， 可提 高退火温度。若因使用Tm值较低的引物或者扩增产物过长等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增。
3）实际使用的RealTime PCR仪是否支持快速扩增循环，初次尝试请进行预实验验证。