鲑鱼精DNA探针法荧光定量PCR试剂盒

鲑鱼精DNA探针法荧光定量PCR试剂盒说明书

货号：M00940

规格：50T

保存：-20℃保存，有效期1年。阳性对照需要单独放置，不要污染其他试剂。

产品组成：

产品简介：

该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

本试剂盒可用于检测鲑鱼精DNA。鲑鱼精DNA也称为鲑鱼睾丸的脱氧核糖核酸钠。本产品是根据探针法荧光定量PCR原理开发的鲑鱼精DNA检测试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2. 引物等组分经过优化，灵敏度高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据鲑鱼精DNA DNA序列高度保守区设计，不会跟其他生物样本的DNA发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
6. 本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。

使用方法：

一、稀释标准曲线样品(样本制备区)

（由于阳性对照浓度高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，避免污染样品或本试剂盒的其他成分）。

1. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光模板稀释液，（最好用带芯枪头，下同）。
3. 在7号管中加入5μL1×10E8拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在6号管中加入5μL1×10E7拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在5号管中加入5μL1×10E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。若无需制作标准曲线，将阳性对照稀释到1×10E5拷贝/μL即可。

二、DNA提取(样本制备区)

1.（选做）如果有N个样品待提取，最好设置N+2个提取，多出的是PC（样品制备阳性对照）和NC（样品制备阴性对照）。可以取阳性对照的1000倍稀释液10μL再加上一定量的水，使总体积与待提取样品的规定体积一致，以此作为PC。另外用水作为NC。

2.用自选方法提取纯化样品DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。

三、试剂配制(试剂准备区)

若有N个待检样品，准备N+2个qPCR管(N个待检样品+1个阴性对照+6个阳性对照)，向各PCR管中分别加入下列成分。

转移至样本准备区。

四、添加模板(模板添加区)

向qPCR管中分别加入5uL模板，顺序为阴性对照（DEPC-H₂O）、待测样品模板、鲑鱼精DNA qPCR阳性对照，离心30秒，立即进行扩增反应。

五、扩增反应(扩增及产物分析区)

将PCR管放置在PCR扩增仪器样品槽相应位置，进行扩增，扩增程序如下：

六、结果分析

1. 如果制作标准曲线，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，推算出其浓度。
2. 如果未制作标准曲线，按照如下标准判定结果：

阳性对照（1×10E5拷贝/μL）结果：Ct值<30，有明显指数增长，呈典型的S型曲线。

阴性对照结果：Ct值>40或无Ct值，无明显指数增长期和平台期。

样本检测结果：Ct值<38，有明显指数增长，表明样本中检测出鲑鱼精DNA，

结果为阳性；Ct值>40或无Ct值，表明样本中未检测出鲑鱼精DNA，

结果为阴性；Ct值在38-40范围，应对样本进行复检，如重复实验结果Ct值仍在38-40范围，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。