DNA 尿素-PAGE 制胶及电泳试剂盒套装（可配置 8%的胶 1000mL）
货号: M02070
规格：1L
保存：Acr-Bis 溶液和上样液短期 4℃保存，长期-20℃保存。
产品组成：
Components | 保存条件 | |
40%Acr-Bis(29:1) | 100 mL×2 | 2-8℃ |
APS（过硫酸铵） | 5 ×0. 1 g | RT |
TEMED | 1 mL | RT/避光 |
2 ×尿素-PAGE 上样液 | 1 mL | 2-8℃ |
5 ×TBE 电泳缓冲液 | 125 mL×4 | RT |
尿素（超纯） | 210 g | RT |
说明书 | 1 份 | |
注：过硫酸铵（APS）为固体粉末，使用前配制成 10% APS 溶液（0.1 gAPS 加 1 mL 双蒸水） 。APS溶液最好现配现用，通常 4℃可保存一周，-20℃能保存半年。
操作步骤：
用于 SSCP-PCR 分析的非变性 PAGE 电泳（其他应用请相应修改参数）。
一、PAGE 浓度和交联度的选择指南
1．尿素-PAGE 一般推荐用 29：1（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺）的交联度，在此条件下，DNA 片段和最适PAGE 浓度对应关系如下：
单链 DNA 长度 | 最佳 PAGE 浓度 | 二甲苯青 FF 迁 移率对应的长度 | 溴酚蓝的迁移率 对应的长度 |
50-400 nt | 8% | 160 nt | 45 nt |
200- 1000 nt | 5% | 260 nt | 65 nt |
750-2000 nt | 3.5% | 460 nt | 100 nt |
二、胶制备尿素-PAGE 胶（参照附表）
1．参照附表的配置合适浓度的 PAGE 胶，摇晃混匀。
2．将配置好的胶倒入胶板，在胶的液面距离达到顶部时停止灌胶，插入梳子。
3. 室温聚合 30-60 分钟（低温抑制聚合反应，故放置室温最佳）。
4. 待胶凝固后拔出梳子，用 0.5×TBE 液冲洗加样孔。
三、样品处理
对一般样品、测序样品、微卫星 DNA、AFLP 样品、DDRT 样品、RPA 样品：将样品跟上样液 1:1 混合，95℃ 3 分钟变性，然后放冰上待用；对 TGGE 样品：可以直接上样。
四、电泳
1．将凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽中加入足够 0.5×TEB 电泳液。
2．预电泳 5-30 分钟后，将冰上放置的样品上样。
3. 连接电源线，打开电源开关。根据胶的大小选择功率（固定功率可以固定产热，这样不容易发生过热而使胶板破裂的现象。如果固定电流或电压，产热都将随电泳时间而变化，不好控制）。对小胶一般用5-6 W 固定功率，大胶用 15-25 W 固定功率。
4. 终止电泳，取出凝胶进行后续的处理（如银染）。
注：如果银染，必须延长固定时间以便洗出尿素，否则残留尿素会干扰后面的银染。
注意事项：
1. APS 溶液不稳定，每次取用后立即放回冰箱，以防失效；若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换 10% APS。
2. PAGE 凝胶的凝聚速度与温度以及 APS、TEMED 的用量密切相关；可通过改变APS及 TEMED 的用量，控制 PAGE 凝胶的聚合速度，凝胶聚合过快不利于操作。
3. 在凝胶配制过程中，尤其是液体混匀步骤，应尽量避免气泡的产生。
4. 丙烯酰胺具有神经毒性，操作时请穿戴实验服和一次性手套。
附表：（单位：尿素为 g ，其余为 mL）
胶浓度 | 胶体积 | 40%Acr-Bis (29:1) | 10×TBE | 尿素 | 10%APS | TEMED | 双蒸水 |
5% | 100 mL | 12.5 | 5- 10 | 42 | 0.5 | 0. 1 | 73.4-68.4 |
6% | 100 mL | 15.0 | 5- 10 | 42 | 0.5 | 0. 1 | 70.0-65.0 |
7% | 100 mL | 17.5 | 5- 10 | 42 | 0.5 | 0. 1 | 66.7-61.7 |
8% | 100 mL | 20.0 | 5- 10 | 42 | 0.5 | 0. 1 | 63.3-58.3 |
9% | 100 mL | 22.5 | 5- 10 | 42 | 0.5 | 0. 1 | 60.0-55.0 |
10% | 100 mL | 25.0 | 5- 10 | 42 | 0.5 | 0. 1 | 56.7-51.7 |
11% | 100 mL | 27.5 | 5- 10 | 42 | 0.5 | 0. 1 | 53.3-48.3 |
12% | 100 mL | 30.0 | 5- 10 | 42 | 0.5 | 0. 1 | 50.0-45.0 |