PicoGreen dsDNA 定量检测试剂盒

PicoGreen dsDNA定量检测试剂盒说明书

货号: M02550

规格：2000T（1mL）

保存：2-8℃避光保存，有效期1年。

产品内容：

产品说明:

在分子生物学的试验过程中，PicoGreen dsDNA定量试剂盒是荧光检测双链DNA并进行定量的一种产品，这种方法非常灵敏。常用于分子生物学技术中的：cDNA文库的构建；用于亚克隆的DNA片段纯化及应用，比如进行DNA定量、产物扩增和引物的进一步检测。疫苗是现代疾病预防中常用的控制方式。如今许多疫苗是细胞培养疫苗，比如重组乙肝疫苗、狂犬病疫苗等大多数疫苗都采用细胞培养的方法生产。其中，疫苗的纯化是关键问题，我们需要尽可能的去除宿主细胞DNA和宿主蛋白。假若宿主细胞的DNA和蛋白同疫苗一起注入人体将会产生不可预料的后果。

常规的DNA含量的检测方法是在260nm（A₂₆₀）处测其吸光值。这种方法的主要缺点是核苷酸、单链核酸和蛋白质对信号的影响很大，并且还会受到核酸制备过程中污染物的干扰，无法区分DNA和RNA，而且这种方法不灵敏（5µg/mLdsDNA溶液A₂₆₀=0.1）。PicoGreen定量检测方法简单、方便，被多家生物制品厂所选择，成为生物制品残留DNA检测的标准。

PicoGreen与DNA双链结合后才发出的荧光，无DNA不发荧光；所发荧光与DNA浓度成正比。在2010年《中国药典》中提出，PicoGreen定量DNA的方法检出限约0.3ng/mL，DNA含量在1.25-80ng/mL范围时线性较好(R²>0.99)。

优点：

1. 该方法可以测定来源于任何表达宿主样品中的双链DNA。
2. 可以直接定量PCR扩增产物而无需从反应混合物中纯化DNA。
3. 远远超出传统紫外A260的检测方法和Hoechst33258的灵敏度。
4. 较高浓度的盐，尿素，乙醇，氯仿，去垢剂，蛋白或琼脂糖对测定无影响。
5. 在等摩尔浓度ssDNA和RNA存在的条件下测定dsDNA，其影响很小。

所需器材：微型荧光计；微量检测皿适配器；1cm石英比色皿

试剂制备：

PicoGreen dsDNA 定量试剂是以1mL的浓缩液形式保存在无水的DMSO（二甲基亚砜）中。实验当天，配制1×PicoGreen试剂的工作溶液，用TE buffer（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5）按1:200 的比例稀释PicoGreen component-A浓缩液。由于试剂容易吸附到玻璃表面，要在塑料容器中配制。PicoGreen试剂见光易降解，所以应将配好的溶液用箔包住或放置暗处避光保存。溶液最好在配制好数小时内使用，以保证最佳结果。注意：TE buffer是1×TE buffer。

实验方法：

1. 标准品工作液的配制：

小牛胸腺嘧啶DNA 干粉1mg（Tris，Nacl等浓度已成标准体系），加入1 mL双蒸水，配制成1mg/mL的标准品工作液；

1. 染料工作液的配置：

5μL PicoGreen加入1 mL TE buffer(注意：用TE buffer将PicoGreen稀释 200 倍，现用现配，注意避光)。

1. 标准品工作液稀释：
2. 母液稀释：取10μL（1 mg/mL）标准品工作液加入到990μL TE buffer溶液中，浓度稀释成10μg/mL，取10μL（10μg/mL）标准品工作液加入到990μL TE buffer溶液中，浓度稀释成100 ng/mL；
3. 倍比稀释：取800μL（100 ng/mL）的标准品工作液加入到200μL TE buffer 溶液中，浓度达到80 ng/mL（药典规定：荧光染色方法DNA 含量在1.25-80 ng/mL范围线性较好，该法DNA检出限为0.3ng/mL），取500μL（80 ng/mL）的标准品工作液加入到500μL TE buffer溶液中，浓度稀释到40 ng/mL；依次倍比稀释，配成20 ng/mL、10 ng/mL、5.0 ng/mL、2.5 ng/mL、1.25 ng/mL、0.625ng/mL的标准品溶液；
4. 标准曲线的制备：倍比稀释后的各梯度标准品溶液和染料工作液各取100μL混匀，避光室温放置5min。使用荧光仪检测样品的荧光值：将混合后的溶液加入微量比色皿，确信不要在样品中引入气泡，轻轻地弹微量检测皿的外部，可以驱散气泡。以TE buffer 缓冲液为blank，激发波长488nm，发射波长520nm，测定样品和空白对照的荧光值；用标准品溶液的浓度（ng/mL）对应的荧光强度作直线回归，制备标准曲线。

1. 测量样品的荧光值。荧光计将给出一个直接的浓度读数，数据可以用来产生 DNA 浓度的标准曲线。