Ultra-Universal One Step SeamLess Cloning Mix说明书
货号:M02560
规格：50T
产品内容：
Component | 50 rxns |
2×Ultra Cloning MasterMix | 250 μL |
PUC19 Vector，Linearized（20 ng/μL） | 20 μL |
500 bp Control Insert （20 ng/μL） | 20 μL |
ddH2O | 1 mL |
保存：-20℃，1年
产品说明（仅供参考）:
该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。
Ultra-Universal One Step SeamLess Cloning Mix是基于同源重组原理开发的一款简单、 快速、高效的无缝克隆试剂盒，该试剂盒不依赖繁琐的酶切、连接步骤可将DNA定向克隆至任 意载体的任意位点，不受酶切位点限制。将载体完全线性化，在插入片段正反向PCR引物的5’端 引入15-25bp线性化载体末端同源序列，将两端带有与载体末端一致序列的PCR产物和线性化 载体按照一定比例混合，在2×Ultra Cloning Master Mix作用下50℃反应5-30min即可进行转 化，完成1-5个片段的定向克隆，阳性率达95%以上。2×Ultra Cloning Master Mix中添加了独特 的辅助因子及稳定剂，有效提高重组效率，经过优化的反应Buffer体系，兼容性更强，更好的保证了复杂体系的阳性克隆率。
产品特点
1. 15分钟可以将一个或者多个长、短PCR扩增片段（平/A端）插入载体。
2. 不受载体和插入片段酶切位点的可用性和平端/粘性末端的限制，可以在任意位点 进行克隆。
3. 无缝克隆， 插入点不会引入不需要的碱基序列。
4. 高效、准确，克隆阳性率＞95% 。
自备材料与试剂
1插入片段，特异引物，线性化载体
2高保真PCR试剂（推荐使用康为CW2965 Super Pfx Master Mix）
3感受态细胞（ DH5α、TOP10）
4胶回收试剂盒（快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒）
5 PCR仪，PCR反应管等。
线性化载体和插入DNA片段的制备回收
1. 线性化载体的制备回收
选择合适的克隆位点对载体进行线性化，载体线性化方式有两种：限制性内切酶酶 切消化，反向PCR扩增。
(1) 酶切所得线性载体，单酶切或者双酶切均可，酶切后推荐用PCR产物纯化试剂盒或者胶 回收试剂盒纯化载体。重组产物转化后出现的假阳性克隆 (无插入片段) 是由酶切不完全未 线性化环状载体转化而形成的，所以我们推荐酶切后胶回收纯化，可以将未线性化载体比例 降低到最低程度。
(2) 反向PCR扩增得到线性化载体，推荐使用高保真聚合酶扩增，以减少扩增突变的引入， 使用环状质粒为模板时，建议使用内切酶Dp n I对PCR产物进行消化，以减少环状质粒模板 残留引起的克隆假阳性。如果使用Dp n I消化质粒模板，需80℃加热20分钟失活Dp n I活性， 以避免重组反应时残留Dp n I对克隆载体的降解。
2. 插入片段的制备与回收
插入片段的制备可用任意PCR酶扩增，克隆过程不受扩增产物平末端或粘末端（A尾）的影 响（重组过程中将被去除，在最终克隆产物中不会出现），但为了减少扩增突变，特别是点突 变实验中，建议使用高保真聚合酶（CW2965 Super Pfx Master Mix）进行扩增。
一般情况下，PCR产物推荐胶回收纯化以降低背景比例，如果插入片段来源于质粒模板，且 该质粒与重组载体具有相同抗性，需用内切酶Dp n I消化PCR产物，以降低背景，提高阳性率。
3. 插入片段的引物设计原则
单片段引物设计原则：在插入片段正反向扩增引物的5’端引入线性化载体两末端的同源序 列，使扩增后的插入片段两端分别带有和线性化载体两末端对应的同源序列（20-25 bp不 包含酶切位点）
5’-上 游载体末端同源序列（20 bp）+酶切位点（可删除）+ 基因特异性 正向扩增引物序列 （20 bp）-3’
5’-下游载体末端同源序列（20 bp）+酶切位点（可删除）+ 基因特异性 反向扩增引物序列 （20 bp）-3’
多片段引物设计原则：载体两端的引物设计原则与单片段克隆时的原则一致，片段之间设计重叠区域引物。
多片段引物设计原理：片段A的反向引物包含与片段B的正向引物20-25 bp的重叠区域和特异引物区域，片段B的反向引物包含与片段C的正向引物20 -25 bp重叠区域和特意引物区 域，依次类推， 两端片段引物包含线性载体两端的同源序列。
如图示：
操作步骤
1. 线性化载体与插入片段的使用量
1.1 载体一般用20-50 ng，插入片段与载体的摩尔比在2:1-3:1之间最佳；多片段连接的情况下， 片段与片段之间摩尔比为1:1。
1.2 单片段克隆用量
最适克隆载体使用量=（0.02 × 克隆载体碱基对数）ng（0.03 p mol）
最适插入片段使用量=（0.04 × 插入片段碱基对数）ng（0.06 p mol）
1.3 多片段克隆用量（2-5个片段）
最适克隆载体使用量=（0.02 × 克隆载体碱基对数）ng（0.03 p mol）
每个插入片段的使用量=（0.02 × 每个插入片段碱基对数）ng（0.03 p mol）
2. 重组反应
2.1 按照下表建立反应体系
组分 | 反应体系 |
2×Ultra Cloning MasterMix | 5 μL |
Linear Vector (20-50 ng) | X μL |
Insert(s) | Y μL |
dd H2O | To 10 μL |
注：可分别设计Linear Vector和Inser（s）的阴性对照，分别检测线性化载体中有无环状质粒残留、插入片 段中有无环状质粒模板残留（当插入片段扩增模板与克隆载体抗性相同时推荐设置阴性对照） 2.2 对照反应体系（可选） | |
组分 | 反应体系 |
2×Ultra Cloning MasterMix | 5 μL |
PUC19 Vector，Linearized（20 ng/μL） | 3 μL |
500 bp Control Insert （20 ng/μL） | 1 μL |
dd H2O | To 10 μL |
2.2 轻轻混匀，在50℃水浴或者PCR仪中反应5-15分钟，超过3个片段的连接，可以延长反应时间 至30分钟。反应结束后，将EP管置于冰上降温后直接转化或者保存于-20℃。
3. 重组产物转化
3.1 克隆感受态置于冰上解冻，取10 μL反应产物加入100 μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰 上静置30分钟。
3.2 42℃水浴热激90秒，立即置于冰上2-3分钟，
3.3 加入600 μL无抗LB液体培养基，37℃摇床220rpm培养30分钟，
3.4 5000rpm离心5分钟，弃多余培养液，剩余100 μL菌液重悬菌体，用无菌涂布棒均匀涂布在 正确抗性的平板上。
3.5 37℃培养箱倒置培养12-16小时。
4. 阳性克隆的鉴定
可根据具体情况，选择菌落PCR鉴定、提取质粒进行限制性内切酶鉴定或测序鉴定。
常见问题
1. 转化效率低
1）引物设计不合理，引物应包含15-25bp同源臂，GC含量40%-60%；
2）感受态效率低，使用新制备或妥善保存的感受态细胞；
3）载体和片段比例或纯度不佳，对反应有抑制，可对片段和载体进行胶回收纯化，纯化产物 溶解在ddH2O中，尽量按照说明书推荐的比例添加；
2. 出现假阳性
1）载体线性化不完全，含环状质粒，建议制备线性化载体时，延长反应时间，使用切胶回收 的方式进行纯化；
2）相同抗性质粒污染，以质粒为模板进行插入片段PCR扩增时，使用Dp nI酶处理或对产物 进行切胶回收；
3）非特异PCR产物扩增，优化PCR反应体系，提高扩增特异性，切胶回收PCR产物。