游离核酸DNA中量提取试剂盒（负压法）说明书
货号: M02710
规格：10T/50T
英文名称：CWhipro Circulating DNA Midi Kit
保存：Spin Columns DG 2-8℃,其他组分室温（15-30℃)
产品组成：
Component | 10 T | 50 T |
Buffer CL | 45 mL | 220 mL |
Buffer CB（concentrate） | 60 mL | 300 mL |
Buffer GTL | 15 mL | 60 mL |
Buffer GW1（ concentrate ） | 3 mL | 13 mL |
Buffer GW2（ concentrate ） | 3 mL | 15 mL |
Buffer EBL | 2 mL | 10 mL |
Proteinase K | 100 mg | 3×180 mg |
Proteinase K Storage Buffer | 5 mL | 30 mL |
Spin Columns DG With Collection Tubes | 10 | 50 |
Tube Extenders (20 mL) | 10 | 50 |
VacConnectors | 10 | 50 |
Centrifuge Tubes (L-1.5 mL) | 10 | 50 |
产品简介
本试剂盒适用于从新鲜或冷冻的血清、血浆、羊水、尿液等无细胞体液中提取游离 DNA 。本试剂盒采用可以特异性结合核酸的吸附柱和独特的缓冲液系统， 样品裂解后， 游离DNA在高盐条件下与硅胶膜结合，在低盐、高pH值时游离DNA从硅胶膜上洗脱下来。本试剂盒使用负压法，同时配备延伸管， 可处理多达5 ml样本，纯化的DNA产量高、质量好，最大限度去除蛋白、色素、脂类及其他抑制性杂质污染。纯化得到的游离 DNA质量稳定、可靠，可直接用于PCR、荧光定量PCR和二代测序等分子生物学实验。
自备试剂：无水乙醇、异丙醇
实验前准备及重要注意事项
1、向每管Proteinase K粉末中加入指定用量的Proteinase K Storage Buffer，使其完全溶解后-20℃保存。配制好的Proteinase K勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。其它组分可以在干燥、室温（15-30℃)环境下稳定保存一年。如需保存更长时间，可置于2-8℃。
Cat. No. | 10T | 50T用量 |
Proteinase K Storage Buffer | 5 mL | 每瓶加入9 mL |
- 样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。
- 本试剂盒最多可以从5 mL血清血浆、4 mL尿液中提取cfDNA。
4、第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer CB中加入异丙醇，混合均匀， 并在试剂瓶标签上做好标记。
5、第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇，混合均匀，并在试剂瓶标签上做好标记。
6、使用前请检查Buffer CL、Buffer CB是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀， 请将Buffer CL、Buffer CB于56℃水浴孵育重新溶解，混匀后使用。
7、实验开始前将水浴锅预热至60℃。
8、可将洗脱缓冲液Buffer EBL预热至60℃。
9、负压装置。
操作步骤
血清、血浆样本（1-5mL）
1、样品处理：
向离心管（自备）中加入1 mL 血清/血浆样本，若样本不足1 mL ，加入PBS溶液补 至1 mL 体积。
注意：当样品量超过1 mL时，请等比例增加 Proteinase K、Buffer CL 和Buffer CB 试剂用量，具体试剂加入量可参考附表1。
2、向以上溶液中加入100 μL Proteinase K ，混匀。
3、加入800 μL Buffer CL ，剧烈震荡至少30秒。
4、60℃孵育30分钟，其间颠倒混匀数次。
5、加入1800 μL Buffer CB（使用前检查是否加入异丙醇），颠倒混匀10次或剧烈震荡15-30秒。
6、冰浴5分钟。
7、正确连接负压装置，将连接管（VacConnectors）插到负压装置的插口上。
8、将吸附柱（Spin Column DG）插入到连接管上。
9、将延伸管（Tube Extenders）插入开盖的吸附柱中。
注意：确保连接管、吸附柱和延伸管连接稳固，防止发生漏液。
10.将冰浴后的混合溶液全部加入延伸管中，开启并调节负压至-900~-800 mbar，缓慢 吸走管中溶液。待溶液完全吸走，关闭负压开关，当压力恢复至0 mbar时，小心移 去延伸管。
11、向吸附柱中加入500 μL Buffer GW1（使用前检查是否加入无水乙醇）, 开启并调节负压至-900~-800 mbar，待溶液完全吸走，关闭负压开关。
12、向吸附柱中加入750 μL Buffer GW2（使用前检查是否加入无水乙醇），开启并调节负压至-900~-800 mbar，待溶液完全吸走，关闭负压开关。
13、向吸附柱中加入750 μL无水乙醇，开启并调节负压至-800~-900 mbar，待溶液完全吸走，关闭负压开关。
14、当压力恢复至0 mbar时，将吸附柱取下，置于新的收集管（Collection Tube ）中，12,000 rpm离心3分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应。
15、将吸附柱置于新的1.5 mL离心管（Centrifuge Tube）中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-150 μL Buffer EBL ，室温放置3分钟，12,000 rpm 离心1分钟，收集 DNA溶液，-20℃保存DNA。
附表1：不同血清/血浆样本量推荐加入试剂量
样本体积 试剂加入量 | 1 mL | 2 mL | 3 mL | 4 mL | 5 m L |
Proteinase K | 100 µL | 200 µL | 300 µL | 400 µL | 500 µL |
Buffer CL | 800 µL | 1.6 mL | 2.4 mL | 3.2 mL | 4 mL |
Buffer CB | 1.8 mL | 3.6 mL | 5.4 mL | 7.2 mL | 9 mL |
尿液样本（1-4ml）
1、样品处理：
向离心管（自备）中加入1 mL 尿液样本。若样本不足 1 mL ，加入PBS溶液补至1 mL体积。
注意：当样品量超过 1 mL 时，请等比例增加 Proteinase K、Buffer GTL 、Buffer CL 和 Buffer CB试剂用量，具体试剂加入量可参考附表2。
2、向以上溶液中加入125 μL Proteinase K ，混匀。
3、加入1 mL Buffer CL ，250 μL Buffer GTL ，剧烈震荡至少30秒。
4、60℃孵育30分钟，其间颠倒混匀数次。
5、加入3.6 mL Buffer CB（使用前检查是否加入异丙醇），剧烈震荡15-30秒。
6、冰浴5分钟。
7、正确连接负压装置，将连接管（VacConnectors）插到负压装置的插口上
8、将吸附柱（Spin Column DG）插入到连接管上。
9、将延伸管（Tube Extenders）插入开盖的吸附柱中。
注意：确保连接管、吸附柱和延伸管连接稳固，防止发生漏液。
10、将冰浴后的混合溶液全部加入延伸管中，开启并调节负压至-900~-800 mbar，缓慢 吸走管中溶液。待溶液完全吸走，关闭负压开关，当压力恢复至0 mbar时，小心移 去延伸管。
11、向吸附柱中加入500 μL Buffer GW1（使用前检查是否加入无水乙醇）, 开启并调节负压-900~-800 mbar，待溶液完全吸走，关闭负压开关。
12、向吸附柱中加入750 μL Buffer GW2（使用前检查是否加入无水乙醇），开启并调节负压至-900~-800 mbar，待溶液完全吸走，关闭负压开关。
13、向吸附柱中加入750 μL无水乙醇，开启并调节负压至-900~-800 mbar，待溶液完全吸走，关闭负压开关。
14、当压力恢复至0 mbar时，将吸附柱取下，置于新的收集管（Collection Tube ）中，12,000 rpm离心3分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应 。
15、将吸附柱置于新的1.5 mL 离心管（Centrifuge Tube）中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-150 μL Buffer EBL，室温放置3分钟，12,000 rpm离心1分钟，收集DNA 溶液，-20℃保存DNA。
附表2：不同尿液样本量推荐加入试剂量
样本体积 试剂加入量 | 1 mL | 2 mL | 3 mL | 4 mL |
Proteinase K | 125 µL | 250 µL | 375 µL | 500 µL |
Buffer CL | 1 mL | 2 mL | 3 mL | 4 mL |
Buffer GTL | 250 µL | 500 µL | 750 µL | 1 mL |
Buffer CB | 3.6 mL | 5.4 mL | 7.2 mL | 9 mL |
