HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit说明书
货号：M02910
规格：100T
别名：通用型逆转录试剂盒（去基因组）
保存：-20℃，1年
产品内容：
Component | 100 T |
gDNA Eraser | 50 µl |
10×gDNA Eraser Buffer | 120 µl |
HiFiScript ，200 U/μl | 100 µl |
5×ScriptRT Buffer | 500 µl |
Primer Mix | 120 µl |
RNase-Free Water | 2 × 1 ml |
产品说明（仅供参考）:
该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。
本产品是用于去除基因组DNA进行反转录的试剂盒。该试剂盒在42℃, 2分钟即可除去基因组DNA。同时由于反转录试剂中含有抑制gDNA Eraser的组分，经过 gDNA Eraser处理后的样品可以直接进行逆转录反应合成cDNA。本试剂盒配有新型高效反转 录酶HiFiScript，新颖突变位点大幅提升酶的转录活性， cDNA第一链合成的效率和产 量更高，可利用pg级的总RNA或mRNA合成cDNA第一链。如逆转录产物cDNA用于下 游荧光定量检测，可在42℃, 15分钟完成逆转录反应。本试剂盒适用于第一链cDNA 的合成和后续的RT-PCR、RT-qPCR、以及全长cDNA文库的构建等。
产品特点
1 ．快速去除基因组：含有去除基因组DNA的gDNA Eraser，只需2分钟即可除去基因组DNA。
2 ．快速逆转录：15分钟即可获得荧光定量PCR模板cDNA第一链合成。
3 ．灵敏度高：可利用pg级总RNA或mRNA模板合成cDNA第一链。
4 ．高效的逆转录效率：新颖突变位点大幅提升酶活性能，获得更高产量的cDNA。
注意事项
1 ．在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套，使用专门的仪器和耗材。
2 ．逆转录体系配制在冰上进行操作，防止RNA发生降解。试剂盒的酶使用后尽快置于-20 ºC保存，并尽量避免反复冻融。
3 ．反应体系可倍比放大，10 μl反应体系可最大使用1 μg总RNA。
4 ．Primer Mix由Oligo(dT)和Random primer配制而成， 也可根据实验需要选用 Oligo-dT Primer或Gene Specific Primer。
5 ．若起始RNA的量小于50 ng，建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购。
6 ．对于二级结构复杂的RNA模板，建议在操作步骤之前，将模板RNA在65℃孵育5分钟立刻置于冰上，短暂离心后进行下一步操作。
使用方法
将模板RNA在冰上解冻；试剂盒组分在室温解冻后立刻置于冰上。使用前将每种溶 液涡旋振荡混匀，并经短暂离心后使用。
一、去除基因组DNA反应
1．根据以下表格在冰上配制反应体系，总体积为10 μl。为了保证反应液配制的准确性，先按反应数+2的量配制预混体系，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。
试剂 | 10 μl反应体系 |
10×gDNA Eraser Buffer | 1 µl |
gDNA Eraser | 0.5 µl |
RNA Template1） | 10 pg-1 μg |
RNase-Free Water | up to 10 µl |
注意： 1 ）如果总RNA量大于1 µg ，请按比例扩大反应体系。若起始RNA的量小于50 ng ，则建议 加入RNA酶抑制剂（ RNasin ）
2 ．涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
3．42℃孵育2分钟（室温反应时，可以延长到30分钟）。
4．反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
二、逆转录反应
1．根据以下表格在冰上配制反应体系，反应液配制请在冰上进行。为了保证反应液配置的准确性，先按数+2的量配制成预混溶液，然后再分装10 μl到每个反应管中，取配制的预混液10 μl加入至已完成去基因组的步骤1反应管中。
试剂 | 20 µl反应体系 |
步骤1反应液 | 10 µl |
HiFiScript，200 U/μl | 1 μl |
Primer Mix 1） | 1 μl |
5×ScriptRT Buffer | 4 μl |
RNase-Free Water | 4 μl |
注意：1）可根据实验需要可使用Oligo-dT Primer或Gene Specific Primer ，建议20 μl 反应体系 Oligo-dT Primer 50pmol，或Gene Specific Primer 2 pmol。
2．混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
3．cDNA合成反应条件：
1）若下游进行荧光定量PCR检测， 42 ℃孵育15分钟， 85 ℃孵育5分钟。
2）若下游进行普通PCR检测， 42 ℃孵育30-50分钟， 85 ℃孵育5分钟。
注意：对于二级结构复杂或GC含量高的模板，可以提高逆转录温度至50 ℃,增强逆转录效率。
4．反应结束后，短暂离心后置于冰上，再进行后续PCR或荧光定量PCR，如果需要长时 间保存，请置于-20℃。
注意：进行Real-time PCR反应时，逆转录产物的加量应不超过PCR反应总体积的1/10。