磁珠法病原微生物DNA/RNA提取试剂盒说明书
货号: M02930
规格：96T
英文名称：Magbead Pathogenic Microbiome DNA/RNA Kit
保存：RT，1年
产品组成：
Component | 96T | |
Buffer LBS-A | 50 mL | |
Buffer WB1 | 100 mL | |
Buffer WB2 | 100 mL | |
RNase-Free Water | 10 mL | |
Proteinase K | 2×1.25 mL | |
Magbeads PN | 2×1 mL | Magbeads PN使用前，涡旋以保证充分重悬 |
Lysis Tubes | 96 |
产品说明（仅供参考）:
本试剂盒适用于从血浆、血清、肺泡灌洗液等生物液体样本中纯化和富集病毒、细菌和真菌等病原微生物DNA及RNA。用本试剂盒纯化的微生物DNA及RNA适用于多种下游应用，包括PCR、RT-PCR、荧光定量PCR、NGS等各种下游实验。
自备仪器、试剂
1. 2/15 mL磁力架或32通道核酸提取仪（例如康为CWE3200/CWE2100）
2. 异丙醇
3. PBS缓冲液
实验前准备及注意事项
1. 使用前请检查Buffer LBS-A是否出现沉淀，如有沉淀出现，请置于56℃水浴重新溶解。
2. 本试剂盒旨在从完整的微生物细胞中分离DNA及RNA，为了保证微生物DNA及 RNA的最佳回收效率，样品应保证新鲜。如果需要储存或运输，最好在2~8°C条件下进行，不可冻融，冻融会损坏微生物细胞的完整性。
3. 为避免由于污染造成的错误结果，请保持工作区域清洁和穿防护服，并合理设置对
4. 照品进行质控。采用适当措施处理样品材料，降低交叉污染的风险。提取过程中，使用DNA/RNA-free的移液器吸头和消耗品，试剂使用完后立即盖好瓶盖，防止污染。
操作步骤
一 手动操作
1. 样本前处理：
1a：尿液、胸腹水、脑脊液等非粘稠体液样本直接取400 μL样本，进行第2步操作。
1b：拭子类样本（如鼻、咽及肛拭子等）涡旋振荡混匀后，直接取400 μL进行第2步实验。
1c：痰液、肺泡灌洗液样本取适量液化痰液样本至1.5 mL 离心管中（液化方法推荐使用1.5倍体积的Buffer GB1，本试剂盒不提供），12,000 rpm离心5 min，弃上清，使用400 μLPBS重悬沉淀后提取。对于含有少量粘稠痰液的肺泡灌洗液，将尽量多的肺泡灌洗液样本先进行离心，小心去除上清，留取下层粘稠部分（含痰液、细胞、菌体）参照痰液样本进行液化处理。
1d：血液类样本
血清、血浆及少量全血样本（少于200μL）可直接取400μL（少量全血使用PBS补足）进行第2步实验，大体积全血样本推荐使用红细胞裂解液（CB3116）处理后再进行提取。
可选去宿主步骤（搭配宿主DNA去除试剂盒例如康为CW3169S）
2. 向Lysis Tubes中加入400μL样本和400 μL Buffer LBS-A，可用以下振荡方式处理：
a）将Lysis Tubes置于室温涡旋振荡10 min；
b）将Lysis Tubes置于恒温混匀仪上以最大振速（2500~2900 rpm）处理10 min；
c）将Lysis Tube 置于样本均质仪中，可根据不同品牌的仪器选择合适的程序进行裂解：如使用MP公司FastPrep-24-5G（6 M/S的速度振荡30 sec，间隔30 sec，共6个循环）。
3. 室温12000 rpm离心1min，转移600μL上清至新的离心管中，加20 μLProteinase K（若经过去宿主处理，则此步不需再加Proteinase K），涡旋震荡混匀5 s后，置于65℃ 600 rpm孵育10 min。
4. 瞬离离心管，确保管壁无液体残留后，在离心管中加入20 μL Magbeads PN和300 μL异丙醇，涡旋5 s后，室温，1500 rpm孵育5 min。
注：Magbeads PN使用前，涡旋以保证充分重悬。
5. 瞬离离心管，确保管壁无液体残留后，将离心管置于磁力架上静置2 min或至磁珠完全吸附，用移液器小心吸弃所有上清。
6. 在离心管中，加入500 μL Buffer WB1，室温，1500 rpm孵育3 min，将离心管置于磁力架上静置2 min或至磁珠完全吸附，用移液器小心吸弃所有上清。
7. 重复步骤6一次。
8. 在离心管中，加入500 μL Buffer WB2，室温，1500 rpm孵育3 min，将离心管置于磁力架上静置2 min或至磁珠完全吸附，用移液器小心吸弃所有上清。
9. 重复步骤8一次。
10.离心管放置于磁力架上，敞盖晾干5 min。
11.在离心管中加入70 μL RNase-Free Water ，用移液器吹打混匀，置于56℃ 600 rpm孵育5 min。瞬离离心管后，将离心管置于磁力架上静置2 min或至磁珠完全吸附，用移液器转移所有上清至新离心管中。
获得的核酸溶液置于-20℃长期保存。
二 与核酸提取仪例如康为CWE3200/CWE2100匹配
1. 样本前处理同手动操作步骤1。
2. 在Lysis Tubes中加入400 μL样本、400 μLBuffer LBS-A，室温振荡处理10 min，振荡方法同手动操作步骤2，室温12000 rpm离心1min。
- 按照下表在96深孔板中分装试剂
位置 | 试剂 | 体积 |
第 1 、7 列 | 异丙醇 | 300 μL |
第 2 、8 列 | Buffer WB1 | 500 μL |
第 3 、9 列 | Buffer WB1 | 500 μL |
第 4 、10 列 | Buffer WB2 | 500 μL |
第 5 、11列 | Buffer WB2 | 500 μL |
第 3 、9 列 | Magbeads PN | 20 μL |
第 6 、12 列 | RNase-Free Water | 70 μL |
- 在分装好试剂的96深孔板第1、7列中加入600 μL步骤1中上清样本、20 μL Proteinase K （若经过去宿主处理，则此步不需再加Proteinase K）。
- 按照下表编辑并运行提取程序：
步序 | 磁棒 位置 | 步骤 名称 | 温度 | 释放 磁珠 | 搅拌 速度 | 时间 | 循环 次数 | 磁吸 次数 | 磁吸 时间 |
1 | 1 | 裂解 | 65℃ | 是 | 中速 | 10 min | 1 | 0 | 0 |
2 | 3 | 收集磁珠 | 0 | 否 | 快速 | 5 s | 1 | 2 | 10 s |
3 | 1 | 结合 | 0 | 是 | 中速 | 5 min | 1 | 2 | 10 s |
4 | 2 | 漂洗 | 0 | 是 | 快速 | 2 min | 1 | 2 | 10 s |
5 | 3 | 漂洗 | 0 | 是 | 快速 | 2 min | 1 | 2 | 10 s |
6 | 4 | 漂洗 | 0 | 是 | 快速 | 2 min | 1 | 2 | 10 s |
7 | 5 | 漂洗 | 0 | 是 | 快速 | 2 min | 1 | 2 | 10 s |
8 | 5 | 干燥 | 0 | 5 min | |||||
9 | 6 | 洗脱 | 56℃ | 是 | 中速 | 5 min | 1 | 3 | 10 s |
10 | 3 | 释放磁珠 | 0 | 是 | 快速 | 5 s |
- 程序运行结束后，取出96深孔板，将第6 、12列中的洗脱液转移至新离心管中， -20℃长期保存。