病原微生物基因组DNA提取试剂盒说明书
货号: M02970
规格：50T
英文名称：Pathogenic Microbiome DNA Kit
保存：BoxⅠ于室温（15-30℃）保存，BoxⅡ于 -20℃保存; 未开封，效期1年
产品内容：
Box Ⅰ: | |
Component | 50T |
Buffer GL | 15 ml |
Buffer GW1（concentrate） | 13 ml |
Buffer GW2（concentrate） | 15 ml |
Buffer GE | 15 ml |
Enzymatic Lysis Buffer | 10 ml |
Proteinase K Storage Buffer | 1.25 ml |
Lysis Tubes | 50 |
Spin Columns DM with Collection Tubes | 50 |
Box Ⅱ: | |
Component | 50T |
Buffer GB1 | 2×20 ml |
Buffer GB2 | 4×25 ml |
Benzonase (250 U/µl) | 100 µl |
Lysozyme | 100 mg |
Proteinase K | 25 mg |
产品说明（仅供参考）:
该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。
本试剂盒是进行微生物组分析的专用样品制备解决方案，适用于从拭子、血液、痰液、肺泡灌洗液等混合样本中纯化和富集细菌、真菌等病原微生物基因组DNA。本试剂盒在纯化过程中，通过差异性裂解宿主细胞以及后续的酶消化，能在有效去除绝大部分宿主DNA的同时，最大程度全面覆盖细菌、真菌等病原微生物DNA位点，获得具有更高覆盖度的微生物组DNA富集产物。用本试剂盒纯化的微生物DNA适用于多种下游应用，包括全基因组测序分析、基于16S rDNA的高灵敏度微生物组分析、以及宏基因组鸟枪法测序分析。
自备试剂及耗材
带有气溶胶屏障的无菌移液器吸头，可防止交叉污染、无水乙醇、微量离心管（2 ml/1.5 ml）、PBS缓冲液（仅某些样品需要）
实验前准备及重要注意事项
1. 向Proteinase K中加入1.25 ml Proteinase K Storage Buffer，-20℃保存。 配制好的Proteinase K（20 mg/ml）勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。
2. 将Lysozyme（100 mg）干粉加入10 ml Enzymatic Lysis Buffer中使其溶解，终浓度为10 mg/ml，分装到无菌管中，-20℃保存。配制好的Lysozyme（10 mg/ml）勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。
3. 使用前在室温或2–8°C下解冻Buffer GB1和Buffer GB2，并充分混匀。解冻后的Buffer GB1和Buffer GB2可以于2–8°C放置1-2周而不影响其活性，长期保存应于-20℃。为了确保最佳性能，冻融不要超过3次。如果一次提取需要的Buffer GB1和Buffer GB2不足一瓶，请确保在超净工作台等无菌条件下使用，并避免剩余缓冲液中微生物的污染和生长。
4. 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇，并做好标记。
5. 使用前请检查Buffer GL是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀出现，请将Buffer GL于56℃水浴重新溶解。
6. 如果下游实验对RNA污染比较敏感，可以在加入Buffer GL前加入4 μl DNase-Free的 RNase A（100 mg/ml），RNase A本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购。
7. 本试剂盒旨在从完整的微生物细胞中分离DNA，为了保证微生物DNA的最佳回收效率，样品应保证新鲜。如果需要储存或运输，最好在2–8℃条件下进行，不可冻融，冻融会损坏微生物细胞的完整性，因此在去宿主DNA时会导致暴露的微生物DNA损失。
8. 为避免由于污染造成的错误结果，请保持工作区域清洁和穿防护服，并合理设置对照品进行质控。采用适当措施处理样品材料，降低交叉污染的风险。提取过程中，使用DNA-free的移液器吸头和消耗品，试剂使用完后立即盖好瓶盖，防止污染。
操作步骤
1. 样本前处理：
1a：对于拭子样品，将拭子棉签部分在0.5 ml PBS中旋转至少20 s，取出棉签前将棉签在管壁上多次挤压，使棉签内的菌液尽量挤出，减少样本损失。
1b：对于粘稠的样本，如痰液等，取约500 µl样本，加入1.5倍体积（约750 µl）的Buffer GB1，37℃, 600 rpm孵育15-30 min，至样本完全液化。
注意：样本体积可以适当增减，并相应调整Buffer GB1的加入量。
1c：对于含有少量粘稠痰液的肺泡灌洗液，将尽量多的肺泡灌洗液样本先进行离心，小心去除上清，留取下层粘稠部分（含痰液、细胞、菌体），加入1.5倍体积的Buffer GB1，37℃, 600 rpm孵育15-30 min，至样本完全液化。
1d：对于血液、脑脊液等非粘稠体液样本，不需要液化处理，直接取适量样本，进行步骤2的操作，离心收集细胞沉淀。
2. 10000 rpm室温离心5-10 min，小心弃除上清。
注意：不要扰动下层细胞沉淀，以免造成样本损失。
3. 加入500 µl Buffer GB2，涡旋混匀，室温，600 rpm孵育10 min。
4. 12000 rpm离心2 min，小心去除上清。
注意：去除上清时不要扰动菌体沉淀，以免造成样本损失。
5. 向沉淀中加入200 µl Buffer GB2，加入2 µl Benzonase，37℃, 600 rpm孵育30 min。
6. 12000 rpm离心2 min，弃上清，加入500 µl Buffer GB2，涡旋混匀，清洗沉淀。重复此步骤一次。
7. 12000 rpm离心2 min，弃上清，最后用小量程的枪头吸净残留的Buffer GB2。
8. 加入180 µl Lysozyme (10 mg/ml)，重悬菌体沉淀，并将菌体重悬液转移到Lysis Tube中。
9. 将Lysis Tube置于37℃，600 rpm孵育20-30 min，然后涡旋10 min或者于恒温混匀仪上以最大振速（2500-2900 rpm）处理10 min。
10. 短暂离心，加入20 µl proteinase K，涡旋混匀，加入200 µl buffer GL，涡旋混匀，56℃，600 rpm孵育30 min。
注意：
1）不要把Proteinase K直接加到Buffer GL中。
2）如需去除RNA，在加入Buffer GL前加入4 μl DNase-Free的 RNase A（100 mg/ml），震荡混匀，室温放置5-10分钟。
11. 12000 rpm离心1 min，小心吸取上清至新的离心管中。
注意：不要吸取到玻璃珠。
- 加入200 µl无水乙醇，涡旋混匀，瞬时离心使溶液收集至管底。
注意：加入无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。
- 将步骤12所得溶液（包括形成的沉淀）全部加入到已装入收集管的吸附柱（Spin Columns DM），若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
- 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
15、向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤15一次。
16.12,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。
注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应（酶切、PCR等）。
- 将吸附柱置于一个新离心管（自备）中，向吸附柱中间部位悬空加入50 μl Buffer GE，室温放置5分钟，12,000 rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
注意：
1）如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0时洗脱效率不高。
2）离心之前室温孵育5分钟可以增加产量。
3）如果要提高DNA的终浓度，可以将步骤17所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤17。
4）保存在水中的DNA会受到酸性水解作用影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃
保存。