柱式法提取组织细胞 miRNA 试剂盒
货号： M03250
规格： 25T/50T/100T
保存：室温(15℃-25℃)干燥保存， 有效期 1 年。
产品组成：
名称 | 包装 (25T) | 包装 (50T) | 包装 (100T) |
裂解液 | 16mL | 27 mL | 55 mL |
Buffer B | 6.5mL | 13 mL | 26 mL |
漂洗液 | 5 mL | 10 mL | 20 mL |
洗脱液 | 1mL | 2 mL | 4 mL |
miRNA 吸附柱 | 50 | 100 | 200 |
2ml 收集管 | 50 | 100 | 200 |
说明书 | 1 份 | 1 份 | 1 份 |
注意：使用前请先在漂洗液中加入异丙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。
产品简介：
金克隆组织细胞 miRNA 提取试剂盒是专门针对 miRNA 提取而开发的新一代产品， 其优势是无毒、无害，此外用该试剂盒提取的小 RNA (Small RNA) 中，长度在 15~200nt 范围的 RNA 在 95%以上，基本不含有大 RNA 和 DNA。该试剂盒中的裂解液是经过长时间 研发改良的，具有更强的的裂解能力和更高的提取灵敏度，试剂盒中的吸附柱采用特殊的硅 基质膜填料，大大增强了其对 RNA 的吸附能力， 尤其是 small RNA(<200 nt)。得到的 RNA 纯度更好， 质量更高。提取简单快速，整个过程 30 分钟左右即可完成， 纯度好，得率高， 可以直接用于各种下游实验。
特点:
1. 完全无毒， 无需酚氯仿等有机试剂抽提。
2. 适用范围广，可用于多种样品 microRNA 及总 RNA 的抽提纯化。
3. 操作简单快速， 整个过程 30 分钟左右完成。
4. 纯度好，得率高，可以直接用于各种下游实验。
自备试剂:
无水乙醇、异丙醇、PBS
操作方法：
- 动物组织样本提取
1 、在液氮条件下充分将组织研磨粉碎，称取一定的样品量(10 mg~35 mg) 于 1.5 mL EP 管 中， 加入 500 μL 裂解液，吸打混匀至组织粉末彻底溶解于裂解液中。室温静置 5min 以充分 裂解细胞。
2 、向上述裂解完毕的裂解液中加入 230 μL Buffer B ，吸打混合均匀。13000 rpm ，4℃离心5min
3 、吸取 600 μL 上清液，转移到新的 1.5 mL EP 管中。向上述溶液中加入 300 μL 无水乙醇，震荡混匀，室温放置 5min。
4 、将上述液体转移至 miRNA 吸附柱，12000 rpm ，4℃， 1min ，收集滤液。
5 、收集 800 μL 滤液至 1.5ml 新 EP 管中，加入 300 μL 异丙醇，震荡混匀。
6、分两次将上述液体转移至新的 miRNA 吸附柱。12000 rpm ，4℃， 1min，弃滤液。
7、向吸附柱中加入 700 μL 漂洗液洗涤一次，12000 rpm ，4℃， 1min ，弃滤液。
8、向吸附柱中加入 500 μL 无水乙醇洗涤一次， 12000 rpm ，4℃， 1min ，弃滤液。
9 、吸附柱 12000 rpm ，4℃空离心 2min ，去掉残留的乙醇。
10 、将吸附柱放入到新 1.5 mL EP 管中，室温放置 2min，使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯 上加入 30 μL 洗脱液，室温静置 2min 。吸附柱 12000 rpm ，4℃离心 2min，洗脱产物即为提 取的 miRNA。
二、细胞样本提取
1 、贴壁细胞： 胰酶消化细胞后，离心收集细胞，用 100μL 1*PBS 重悬细胞后，加入 500 μL 裂解液，吸打混匀至细胞彻底溶解于裂解液中。室温静置 5min 以充分裂解细胞。
2 、悬浮细胞： 直接离心后，收集细胞沉淀，加入 500 μL 裂解液，吸打混匀至细胞彻底溶解于裂解液中。室温静置 5min 以充分裂解细胞。
3 、向上述裂解完毕的裂解液中加入 250 μL Buffer B ，吸打混合均匀。13000 rpm ，4℃离心 5min。
4 、吸取 700 μL 上清液，转移到新的 1.5 mL EP 管中。向上述溶液中加入 300 μL 无水乙醇， 震荡混匀，室温放置 5min。
5 、将上述液体转移至 miRNA 吸附柱 A1 ，12000 rpm ，4℃， 1 min ，收集滤液。
6 、收集 950 μL 滤液至 1.5ml 新 EP 管中，加入 400 μL 异丙醇， 震荡混匀。
7、分两次将上述液体转移至 miRNA 吸附柱 A2 。12000 rpm ，4℃， 1 min ，弃滤液。
8、向吸附柱中加入 700 μL 漂洗液洗涤一次，12000 rpm ，4℃， 1 min ，弃滤液。
9 、向吸附柱中加入 500 μL 无水乙醇洗涤一次， 12000 rpm ，4℃， 1 min ，弃滤液。
10 、吸附柱 12000 rpm ，4℃空离心 2min ，去掉残留的乙醇。
11、将吸附柱放入到新 1.5 mL EP 管中，室温放置 2min，使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上 加入 30 μL 洗脱液，室温静置 2min 。吸附柱 12000 rpm ，4℃离心 2min，洗脱产物即为提取 的 miRNA。
提取的 miRNAs 可以用于特异性引物的检测：
采用本试剂盒提取的 miRNA 质量进行检测，样品包括组织、细胞， 为了进一步检测本试剂盒提 取的 miRNA 是否可以特异性的应用于荧光定量 PCR ，设计了针对组织、细胞的特异性引物 (m29a-3p ，hsa-mi24) 进行验证，通过荧光定量 PCR 分析发现， 其溶解曲线比较整齐， 说明是 引物特异性扩增；且其融解曲线特异性好并且 CT 值接近，说明本方法能够取得 miRNA 可以稳 定应用于特异性引物的荧光定量 PCR 检测。