柱式超纯动物RNA小提试剂盒

柱式超纯动物 RNA 小提试剂盒

货号 ：M03320

规格 ：50T

保存 ：常温，其中 RNase-free DNase 4℃保存， 12 个月。

产品说明 ：

本产品利用 RNA 在特定缓冲体系下能够高效结合硅基质材料的原理， 采用硅胶膜离心吸附柱， 适用于从培养细胞和动物组织中提取总 RNA，可以有效提取分子量大于 200 nt 的 RNA。提取过程中，无需使用苯酚氯仿等，采用 DNase 柱上处理，彻底去除基因组 DNA 残留，提取的RNA 样品 经 PCR 检测不含基因组 DNA，且极少含蛋白质和其它杂质的污染。本产品操作简单快速，且提取 的 RNA 纯度高，可直接用于 RT-PCR、Northern blot、构建 cDNA 文库等各种分子生物学实验。

产品组份 ：

实验准备

用户需自备试剂：β-巯基乙醇

1. RNase-free DNase 母液的配制： 用 1 mL RNase-free 注射器吸取 550 µL RNase-free ddH2O，打 进装有 RNase-free DNase (2000 U) 干粉的玻璃瓶中， 轻柔混匀， 分装后-20℃保存(可保存 9 个月)。

注：从-20℃融化后的 RNase-free DNase 母液保存于 4℃(可保存 6 周)，不要再次冻存。

2. 组织/细胞裂解液可能会形成沉淀， 请于 60 ℃加热溶解， 然后恢复至室温后使用。请根据所提取样品数量确定需要的“组织/细胞裂解液”的用量， 并吸取转移至一个新的离心管中， 再添加所取 “组织/细胞裂解液”体积 1%的β-巯基乙醇。建议该裂解液现用现配。若配好的裂解液没有用完，可 在 4℃保存 1 个月。

3. 初次使用前请在漂洗液 2 (WB2)中按瓶标加入 48 mL 无水乙醇，并做好标记。

操作步骤——培养细胞

1. 柱平衡：将吸附柱放入 2 mL 收集管中，向吸附柱中加入 500 µL 柱平衡液， 12000 rpm 离心 2 min ，倒掉收集管中的废液。请使用当天处理过的柱子。

2. 细胞裂解：

1) 贴壁细胞：彻底吸弃培养液，按照每 6- 10 cm2 面积加入 600 µL 组织/细胞裂解液(使用前 请新鲜加入β-巯基乙醇)，用移液器吹打 3-5 次使细胞裂解。

2) 细胞悬液： 500 x g 离心收集细胞， 彻底吸弃培养液， 每 5×106- 1×107 细胞加入 600 µL 组织 /细胞裂解液(使用前请新鲜加入β-巯基乙醇)，用移液器吹打 3-5 次使细胞裂解。

3. 12000 rpm 离心 2 min，小心吸取上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中，尽量避免触及管中的 细胞碎片沉淀。

4. 缓慢加入 0.5 倍滤液体积的无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀) ，将得到的溶液和沉淀 一起转入吸附柱(吸附柱放在收集管中)， 12000 rpm 离心 30 s，弃除收集管中的废液，将吸附柱 放回收集管中。

5. 向吸附柱中加 350 µL 漂洗液 1 (WB1) ，12000 rpm 离心30 s，弃除收集管中的废液，将吸 附柱放回收集管中。

6. RNase-free DNase 工作液的配制： 取 10 µL RNase-free DNase 母液放入新的 RNase-free 离心管 中，加 70 µL 膜反应液轻柔混匀。

7. 向吸附柱中央加入 80 µL RNase-free DNase 工作液，室温放置 15 min。

8. 向吸附柱中加入 350 µL 漂洗液 1 (WB1) ，12000 rpm 离心 30 s，弃除收集管中的废液，将 吸附柱放回收集管中。

9. 向吸附柱中加入 500 µL 漂洗液 2 (WB2)(使用前请先检查是否已加入乙醇)， 12000 rpm 离心 30 s ，弃除收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

10. 重复操作步骤 9 一次。

11. 室温 12000 rpm 离心 3 min，此步骤十分重要，否则残留的乙醇(WB2 中的成分)会影响 RNA 的使用。

12. 将吸附柱放入一个新的 1.5 mL 无菌离心管中，向吸附柱中央加入 50- 100 µL RNase-free ddH2O，室温放置 1 min ，12000 rpm 离心 1 min，得到 RNA 溶液。所得 RNA 溶液应立即使用或适 量分装后存放于-80℃待用。

操作步骤——动物组织

1. 柱平衡：将吸附柱放入 2 mL 收集管中，向吸附柱中加入 500 µL 柱平衡液， 12000 rpm 离心

2 min ，倒掉收集管中的废液。请使用当天处理过的柱子。

2. 组织匀浆及裂解：

1) 液氮研磨：取 300 µL 组织/细胞裂解液(使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇)加入到

1.5 mL 离心管中。组织样品经液氮研磨后， 将研磨成粉末状的样品(10-20 mg) 加入到上述含有 300µL 组织/细胞裂解液的 1.5 mL 离心管中，剧烈震荡混匀直至裂解液中无明显沉淀。

2) 电动匀浆器：取 300 µL 组织/细胞裂解液(使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇)加入 到 1.5 mL 离心管中，取 10-20 mg 的组织加入上述含有 300 µL 组织/细胞裂解液的离心管中，使用 电动匀浆器彻底研磨。

3) 向上述组织裂解混合物中加入 590 µL RNase-free ddH2O 和 10 µL Proteinase K，混匀后 56℃ 孵育 10-20 min。

注：组织样品不能超过 20 mg，否则提取 RNA 的得率和纯度会下降。

3. 12000 rpm 离心 2 min，小心吸取管中的上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中，尽量避免触及 管中的细胞碎片沉淀。

4. 缓慢加入 0.5 倍上清液体积的无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀) ，将得到的溶液和沉 淀一起转入吸附柱(吸附柱放在收集管中)， 12000 rpm 离心 30 s，弃除收集管中的废液，将吸附 柱放回收集管中。

5. 向吸附柱中加 350 µL 漂洗液 1 (WB1) ，12000 rpm 离心30 s，弃除收集管中的废液，将吸 附柱放回收集管中。

6. RNase-free DNase 工作液的配制： 取 10 µL RNase-free DNase 母液放入新的 RNase-free 离心管 中，加 70 µL 膜反应液轻柔混匀。

7. 向吸附柱中央加入 80 µL RNase-free DNase 工作液，室温放置 15 min。

8. 向吸附柱中加入 350 µL 漂洗液 1 (WB1) ，12000 rpm 离心 30 s，弃除收集管中的废液，将 吸附柱放回收集管中。

9. 向吸附柱中加入 500 µL 漂洗液 2 (WB2) (使用前请先检查是否已加入无水乙醇) ，12000 rpm 离心 30 s ，弃除收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

10. 重复操作步骤 9 一次。

11. 室温 12000 rpm 离心3 min。此步骤十分重要，否则残留的乙醇(WB2 中的成分)会影响 RNA 的使用。

12. 将吸附柱放入一个新的 1.5 mL 无菌离心管中，向吸附柱中央加入 50- 100 µL RNase-free ddH2O，室温放置 1 min ，12000 rpm 离心 1 min，得到 RNA 溶液。所得 RNA 溶液应立即使用或适 量分装后存放于-80℃待用。

注意事项 ：

1． 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放 于普通住宅区。

2． 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。