固定组织RNA提取试剂盒说明书
货号: M03360
规格：50T
英文名称：RNApure FFPE Kit
保存：DNase I及10×Reaction Buffer -20℃保存，其它组分室温（15-30℃)
产品组成：
Component | CW0535S 50 preps |
DNase I | 1000 U |
10×Reaction Buffer | 1000 μl |
Buffer DS | 30 ml |
Buffer GTL | 15 ml |
Buffer GL | 25 ml |
Proteinase K | 12.5 mg |
Proteinase K Storage Buffer | 1.25 ml |
Buffer RW1 | 40 ml |
Buffer RW2（concentrate） | 11 ml |
RNase-Free Water | 10 ml |
Spin Columns RS with Collection Tubes | 50 |
RNase-Free Centrifuge Tubes（1.5 ml） | 50 |
产品简介
本试剂盒适用于从福尔马林固定、石蜡包埋的组织中有效纯化总RNA。适合从小于30 mg的石蜡包埋组织或切片中抽提高纯度的总RNA，本试剂盒无需使用酚/氯仿抽提和异丙醇沉淀，一小时内即可完成多个样品的抽提。本品使用专门优化的裂解液和蛋白酶K，释放福尔马林固定或组织切片样本中的RNA，无需过夜操作；消化后的样品在较高的温度孵育后，去除由福尔马林交联造成的抑制作用，有效释放组织切片中的RNA，而避免危害RNA的完整性；优化的缓冲系统使裂解液中的RNA可特异结合到硅胶吸附膜上，而其他污染物可流过膜；可通过漂洗步骤有效去除，经过洗脱的RNA可直接用于RT-PCR、Real-Time PCR和印迹分析等实验。
自备试剂：无水乙醇（新开封或提取RNA专用）、10mM PBS(pH7.4)。
实验前准备及重要注意事项
1. 向Proteinase K中加入0.625 ml Proteinase K Storage Buffer使其溶解，-20℃保存。配制好的Proteinase K勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。
2. 预防RNase污染，应注意以下几方面：
1）使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
2）玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。
3）配制溶液应使用无RNase的水。
4）操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
3. 获得样品后，要尽快将样品在4%-10%的福尔马林中固定，固定时间以14-24小时为宜，时间过长易导致RNA断裂，影响下游实验。
4. 确保包埋前的样品彻底脱水，残留的福尔马林会抑制Proteinase K的作用。
5. 第一次使用前应按试剂瓶标签说明先在Buffer RW2中加入无水乙醇。
6. 使用前请检查Buffer GTL、Buffer GL和Buffer DS是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将Buffer GTL、Buffer GL和Buffer DS于56℃水浴重新溶解。
操作步骤
1．样本处理
1a. 石蜡包埋样本：用手术刀将组织块中多余的石蜡修剪掉，露出组织后切成5-10 µm的薄片。
注意：如果样品表面已经暴露在空气中，请将接触空气的2-3片弃掉不用。
1b. 福尔马林等固定液中的样本：取约20 mg的样本，切成小块，置于离心管中，加入500 μl 10mM PBS（pH7.4），涡旋振荡，12,000 rpm（～13,400×g）离心1分钟，弃上清，重复3次，可直接进行第3步操作。
2．选择方案 A 或方案 B 去除石蜡
方案 A
A1. 取约1×1 cm2的切片（共约4-5片切片）置于离心管（自备）中，加入500 μl Buffer DS，涡旋震荡10秒。56°C孵育3分钟。
A2. 12,000 rpm离心2分钟，小心吸弃上清，注意不要吸到沉淀。
方案 B
B1. 取约1×1 cm2的切片（共约4-5片切片）置于离心管（自备）中，加入1 ml二甲苯，盖紧管盖，涡旋震荡10秒。
B2. 12,000 rpm离心2分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。
B3. 加入1 ml无水乙醇，涡旋震荡混匀。12,000 rpm离心2分钟，弃上清，注意不要吸弃沉淀。
B4. 打开管盖，室温或最高至37°C孵育10分钟，直至无乙醇残留。
3. 加入150 μl Buffer GTL，重悬沉淀；加入10 μl Proteinase K，涡旋震荡混匀。
4. 56℃孵育15分钟，直至样品完全溶解。80℃孵育15分钟。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
注意：
1）此步骤的目的是修复由甲醛变性的核酸，孵育的温度过高或时间过长可能造成RNA断裂，产生RNA碎片。
2）56℃孵育后的样品可置于室温，直至水浴锅或干浴锅温度达到80℃后再把样品置于80℃孵育。
5. 置于冰上3min，12,000 rpm离心15分钟，将上清转移至新的离心管中，小心不要吸到沉淀。
6. 在上清中加入320 μl Buffer GL，涡旋震荡彻底混匀。
7. 加入720 μl无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。
注意：加入无水乙醇后，可能有少量沉淀物析出，但不影响后续操作。
8. 将步骤7中所得的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱（Spin Columns RS）中， 若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
可选步骤：若需去除基因组DNA，可按照以下步骤进行
a．向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1，12,000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
b．配制DNase I 混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8 μl 10×Reaction Buffer和20 μl DNase I（1 U/μl），混匀， 配制成终体积为80 μl的反应液。
c．向吸附柱中直接加入80 µl DNase I 混合液，20-30℃孵育15分钟。
d．向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1，12,000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附
柱重新放回收集管中。
9. 向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
10. 重复步骤9。
11. 12,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。
注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应（酶切、PCR等）。
12. 将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-50 μl RNase-Free Water，室温放置2-5分钟，12,000 rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-20℃保存RNA。
注意：
1）RNase-Free Water体积不应小于20 μl，体积过小影响回收率。
2）如果要提高RNA的产量，可用20-50 μl新的RNase-Free Water重复步骤12。
3）如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤12。