无内毒素质粒大量提取试剂盒 (带附件:RNase A 300u1×2支 内毒素清除剂100mL×1瓶 )

无内毒素质粒大量提取试剂盒说明书

货号：M03410

规格：10T

保存：RT，复检期1年。（注：RNase A以附件形式发货，收到未使用前请-20℃保存；内毒素清除试剂常温保存，开盖使用后请于2-8℃保存）

产品组成：

产品说明：

本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的原理特异性提取质粒DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。内毒素清除剂可最大限度地除去内毒素。从50-100mL大肠杆菌LB培养液中，可快速提取150-250μg高纯度质粒DNA，提取率达85-90%。使用本试剂盒提取的质粒DNA纯度高，可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。

使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签（每瓶需单独加入60mL无水乙醇）。P1在使用前先加入RNase A（将试剂盒中提供的RNase A全部加入），混匀，置于2-8℃保存。如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

第一次开盖使用后请将内毒素清除试剂于2-8℃保存，可以缩短使用时的冰上预冷时间。

操作步骤（仅供参考）:

1. 取50-100mL细菌培养物，11000rpm离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
2. 向留有菌体沉淀的离心管中加入4mL P1(请先检查是否已加入RNase A），使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意：如菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。
3. 向离心管中加入4mL P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：混匀一定要温和，以免污染细菌基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过5min，以免质粒被破坏。
4. 向离心管中加入4mL P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。11000rpm离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
5. 加入上清1/5体积的冰上预冷内毒素清除剂，振荡混匀溶液变浑浊，冰浴5-10min至溶液变清亮。
6. 42℃水浴5min，不时振荡，溶液又变浑浊，11000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油相含内毒素。
7. 将含质粒DNA的上层水相转移至新管，弃下层油相，注意不要吸入油状相。重复抽提三次，即重复步骤5-7三次。
8. 加入0.5倍上清体积的无水乙醇，充分混匀后加入吸附柱(吸附柱加入收集管中)，室温放置2min，11000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
9. 向吸附柱中加入7mL漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，11000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
10. 向吸附柱中加入7mL漂洗液，11000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
11. 11000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验，如酶切、PCR等。
12. 将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加1-2mL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，11000rpm离心2min。
13. 为增加质粒的回收效率，可将洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置2min，11000rpm离心2min。

注意事项：

1. 使用前请先检查P2和P3是否出现混浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。P2、P3、漂洗液使用后应立即拧紧盖子。
2. 洗脱缓冲液体积不应少于500μL，体积过小影响回收效率；洗脱液的pH值对洗脱效率也有影晌，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率，DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
3. 如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，使用100-200mL过夜培养物，同时按照比例增加P1、P2和P3的用量，吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。
4. DNA浓度及纯度检测：得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。得到的DNA可用琼脂糖疑胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD₂₆₀处有显著吸收峰，OD₂₆₀值为1相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA。OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响吸光值，但并不表示纯度低。