革兰氏阳性菌基因组DNA提取试剂盒 (带附件:RNase A 1m1×1支 溶菌酶 3mL×1瓶 )

革兰氏阳性菌基因组DNA 提取试剂盒说明书

货号：M03460

规格：50T/ 100T

保存：室温(15℃-25℃) 干燥保存，复检期12 个月，2℃-8℃保存时间更长。

试剂盒内容：

产品简介：

本试剂盒采用可以特异性结合DNA 的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，提取革兰氏阳性菌基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，能够高效专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA 片段大，纯度高，质量稳定可靠。使用本试剂盒提取的基因组DNA 可用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern 杂交等实验。

操作步骤（仅供参考）：

使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1. 取细菌培养液1mL，12000rpm 离心1min.，尽量吸除上清。
2. 向菌体中加入200µL溶液A，振荡或用移液器吹打使菌体充分悬浮，向悬浮液中加入20µL的RNase A (10mg/ml)和50µL溶菌酶，充分颠倒混匀，室温放置30min-60min。
3. 向管中加入20µL的蛋白酶K (10mg/ml)，充分混匀，55℃消化30-60min，消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止，此时可见菌液呈清亮粘稠状。
4. 向管中加入200µL溶液B，充分颠倒混匀，如出现白色沉淀，可于75℃放置15-30min，沉淀即会消失，不影响后续实验。如果溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能会导致DNA 的提取量以及纯度降低，还可能堵塞吸附柱。
5. 向管中加入200µL无水乙醇，充分混匀，此时还可能会出现絮状沉淀，不影响DNA 的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入到吸附柱中，静置2min。
6. 12000rpm 离心2min. 弃废液，将吸附柱放入收集管中。
7. 向吸附柱中加入600µL漂洗液(使用前请先检查是否己加入无水乙醇)。12000rpm 离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
8. 向吸附柱中加入600µL漂洗液，12000rpm 离心l min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
9. 12000rpm 离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR 等。

10、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200µL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm 离心1min。

11、离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm 离心2 min，即可得到高质量的细菌基因组DNA。

注意事项：

1. 样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA 片段较小且提取量下降。
2. 若试剂盒中的溶液出现沉淀，可在65℃水浴中重新溶解后再使用，不影响提取效果。
3. 如果实验中的离心步骤出现柱子堵塞的情况，可适当延长离心时间。
4. 洗脱缓冲液的体积最好不少于50µL，体积过小会影响回收效率；洗脱液的pH 值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其pH 值在8.0 左右(可用NaOH 将水的pH 值调至此范围)， pH 值低于7. 0 会降低洗脱效率。DNA 产物应保存在-20℃，以防DNA 降解。
5. DNA 浓度及纯度检测：得到的基因组DNA 片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的DNA 片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA 应在OD260 处有显著吸收峰，OD260 值为1.0 相当于大约50μg/mL 双链DNA、40μg/mL 单链DNA。OD260/0D280 比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH 值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。
6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。