革兰氏阳性菌质粒大量提取试剂盒 (带附件:RNase A 300u1×2支 溶菌酶 10mL×1瓶 )

革兰氏阳性菌质粒大量提取试剂盒说明书

货号：M03470

规格：10T

保存：RT，复检期1年。（注：RNase A、溶菌酶以附件形式发货，收到未使用前请-20℃保存）

产品组成：

注意：使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签（每瓶需要单独加入45mL无水乙醇）。溶液Ⅰ在使用前先加入RNase A（将试剂盒中提供的RNase A全部加入），混匀，置于2-8℃保存。如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

操作步骤（仅供参考）:

1. 取50-200mL细菌培养物，11000rpm离心5min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
2. 向留有菌体沉淀的离心管中加入5mL溶液Ⅰ和1mL溶菌酶，混匀。37℃水浴30min以上（根据菌液量可适当加长水浴时间，（请先检查溶液Ⅰ是否已加入RNaseA），使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。
3. 向离心管中加入5mL溶液Ⅱ，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：混匀一定要温和以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过5min，以免质粒受到破坏。
4. 向离心管中加入7mL溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。11000rpm离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。注意：溶液Ⅲ加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
5. 取上一步上清，加入0.5倍体积无水乙醇，充分混匀。（体积过多可分两次混合，然后上柱）
6. 将上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室温放置2min，11000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中(如果一次加不完，可分两次吸附)。
7. 向吸附柱中加入7mL漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），11000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
8. 向吸附柱中加入7mL漂洗液，11000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
9. 11000rpm离心5min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR等。
10. 将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加1-2mL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，11000rpm离心2min，收集质粒DNA溶液。
11. （可选）为了增加质粒的回收率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置5min，11000rpm离心2min。

注意事项：

1. 使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、漂洗液使用后应立即拧紧盖子。
2. 洗脱缓冲液体积不应少于500μL，体积过小影响回收效率；洗脱液的pH值对洗脱效率也有影晌，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率，DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
3. 如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，使用400-800mL过夜培养物，同时按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。
4. DNA浓度及纯度检测：得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。得到的DNA可用琼脂糖疑胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD₂₆₀处有显著吸收峰，OD₂₆₀值为1相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA。OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响吸光值，但并不表示纯度低。