酵母基因组DNA大量提取试剂盒 (带附件:RNase A 300u1×2支 蛋白酶K 1m1×5支 酵母破壁酶 1.25mL×5 )

酵母基因组DNA大提试剂盒说明书

货号：M03680

规格：10T

保存：RT，复检期1年。2-8℃保存时间更长。（注：RNase A、蛋白酶K、酵母破壁酶以附件形式发货，收到未使用前请-20℃保存）

产品组成：

产品说明：

本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，提取酵母基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，能够高效专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。使用本试剂盒提取的基因组DNA可用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。

使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签（每瓶需单独加入45mL无水乙醇）。如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

操作步骤（仅供参考）:

1. 在离心管中收集酵母细胞20-40mL(不超过10⁹cells)，10000rpm离心1min，尽量吸除上清。
2. 酵母细胞壁的破除：向酵母菌体中加入9mL山梨醇Buffer。充分悬浮菌体，加入600μL酵母破壁酶和100μL巯基还原剂，充分混匀。30℃处理1-2h，期间可颠倒离心管混匀数次。
3. 10000rpm离心lmin，弃上清，收集沉淀。
4. 向沉淀中加入5mL溶液A，充分悬浮沉淀，向悬浮液中加入50μL的RNaseA，充分颠倒混匀，室温放置10min。
5. 加入500μL的蛋白酶K，充分颠倒混匀。65℃水浴消化30-60min，消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止。
6. 加入5mL溶液B，再加入5mL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，室温放置2min。
7. 10000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
8. 向吸附柱中加入7mL漂洗液(使用前请先检查是否己加入无水乙醇)。10000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
9. 向吸附柱中加入7mL漂洗液，10000rpm离心lmin，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
10. 10000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR等。
11. 将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加1-2mL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，10000rpm离心lmin。
12. 离心所得洗脱液再加入吸附柱中，10000rpm离心2min，即可得到高质量的基因组DNA。

注意事项：

1. 样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。
2. 若试剂盒中的溶液出现沉淀，可在65℃水浴中重新溶解后再使用，不影响提取效果。
3. 如果实验中的离心步骤出现柱子堵塞的情况，可适当延长离心时间。
4. 洗脱缓冲液的体积最好不少于1mL，体积过小会影响回收效率；洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率。DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
5. DNA浓度及纯度检测：得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。得到的DNA可用琼脂糖疑胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD₂₆₀处有显著吸收峰，OD₂₆₀值为1相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA。OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响吸光值，但并不表示纯度低。