线粒体DNA 提取试剂盒说明书
货号：M03720
规格：50T/100T
保存：2-8℃，有效期12个月。DNase I 和Rnase A -20℃保存。线粒体裂解液使用前常温保存。
试剂盒组成：
组份 | 50T | 100T | Storage |
细胞裂解液 | 50 mL | 100 mL | 2-8℃ |
线粒体清洗液 | 25 mL | 50 mL | 2-8℃ |
DNase I | 12mg | 22mg | -20℃ |
Rnase A | 0.5ml | 1ml | -20℃ |
DNA酶反应液 | 6ml | 12ml | 2-8℃ |
线粒体裂解液 | 10ml | 20ml | RT |
蛋白沉淀液 | 7.5ml | 15ml | 2-8℃ |
核酸助沉剂 | 0.5ml | 1ml | 2-8℃ |
TE缓冲液 | 15ml | 30ml | 2-8℃ |
产品简介：
线粒体DNA 提取的关键是尽可能的去掉核DNA。本试剂盒利用差速离心到比较纯净的线粒体，再利用DNA 酶消化裂解缓冲系统等多步骤去掉核DNA，最后得到纯净的线粒体DNA。可用于PCR 等对纯度要求较高的实验。
本试剂盒用于从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体。适合于动物软组织（肝或脑组织）和硬组织（肌肉）以及培养细胞线粒体DNA 的提取制备。不适合植物及其他标本的提取。
操作步骤（仅供参考）：
准备工作：在DNA 酶I 中加入600ul（50T）或者1100ul（100T）的DNA 酶反应液，适当分装后-20℃保存。线粒体裂解液保存于常温，如有沉淀37℃水浴溶解，离心机温度下降到4℃（2-8℃），如无低温离心机，也可以常温离心，并将离心时间为10min 的改为5min，但最后所得DNA 品质及产量可能会有一定影响。
1. 样本处理
a. 组织匀浆：称取100~200 mg 新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS 或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1.0 mL 冰预冷的Lysis Buffer，0℃冰浴上下研磨组织20 次；
b. 培养细胞匀浆：消化细胞，PBS 洗涤，800×g 5~10 min 离心收集细胞。计数。每次提取需要5×107 个细胞，加入1.0 mL 冰预冷的Lysis Buffer 重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃冰浴研磨30~40次；
2. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4℃，1000× g 离心5 min；
3. 取上清，加入一新的离心管中，4℃，1000× g 再次离心5 min。
4．取上清，加入一新的离心管中，4℃，12,000 × g 离心10 min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底；
5. 在线粒体沉淀中加入0.5 mL Wash Buffer 重悬线粒体沉淀，4℃，1000× g 离心5 min；
6．取上清，加入一新的离心管中，4℃，12,000 × g 离心10 min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底；
7. 加入100ul DNA 酶反应液重悬线粒体，吹打均匀后，再加入10ul DNase I 溶液（见准备工作），混匀，37 度水浴10min。此步为消化线粒体表面吸付的核DNA。4℃，12,000 × g 离心5 min。尽可能的弃上清，再加入200ul TE 重悬线粒体沉淀，离心，洗去残留的DNA 酶。
8. 得到的沉淀，用200ul TE 重悬线粒体沉淀。加入10ul RNase A。加入200ul 线粒体裂解液，轻轻混匀（不可吹打），放置1-2min 左右，不超过5min，再加入150ul 蛋白沉淀液，迅速混匀。4℃，12,000 × g 离心5 min。此步骤可进一步去除核DNA。
9．取上清，加入一新的离心管中（如用于酶切分析，可加入此步：可选用等体积的酚氯仿异戊醇25:24:1 抽提一次，再用氯仿抽提一次，或者直接用氯仿抽提两次，一般来说，此步可去掉一些微量蛋白及糖类，但会造成线粒体DNA 的损失，因而用于PCR 时可省，并不影响后续实验），加入0.6 倍体积的异丙醇（如无异丙醇，可加入2.5 倍体积的乙醇沉淀DNA，如离心管太满可分两管）及5-10ul 核酸核酸助沉剂，混匀，-20℃沉淀半小时左右（此步可省），4℃，12,000 × g 离心10 min。
10. 弃上清，再加入1ml 70%乙醇清洗，4℃，12,000 × g 离心10 min。重复用70%乙醇洗一次。
11. 弃上清，再次离心1min 吸弃上清，不要碰到管底，开盖凉干约5-10 分钟。
12．加入20-30ul TE 缓冲液，轻弹管底，37 度水浴5 分钟，线粒体DNA 溶解。
13. 进行DNA 电泳检测及-20 度保存，进行下步的实验。
注意事项：
1. 为保证获得完整及尽可能多的线粒体，匀浆条件要示：第一是全程低温操作。第二是快速。第三，如用条件可将匀浆后的碎片在显微镜下观察。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。
2. 线粒体DNA 本身含量很低，如果电泳检测不到，可加大上样量，用更少量的TE 溶解沉淀，或者直接进入PCR 检测。
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
4. 以离心力g 计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。
附：一般低温度心机都有离心力显示，如果没有，可以用以下公式简单的换算。
转速与离心力换算
G＝1.11×(10-5)×R×[rpm]2
G 为离心力，一般以g（重力加速度）的倍数来表示；
[rpm]2 即：转速的平方； R 为半径，单位为厘米。