磁珠法固定组织DNA提取试剂盒

新型磁珠法固定组织DNA提取试剂盒说明书

货号: M03810

规格：96T

英文名称：NuClean Magbead FFPE DNA Kit

保存：室温（15-30℃）

产品内容

产品简介

该试剂盒提供了一种简单、快速、高效的从石蜡包埋组织中提取DNA的方法。实验过程中可采取无毒的脱蜡剂去除石蜡，降低实验过程中对实验者的危害。组织裂解后，DNA结合于硅基包被磁珠表面。漂洗后，高纯度的DNA洗脱于TE或去离子水中。经过纯化的DNA可以直接用于PCR、 Real-time PCR、 SNP基因分型、 STR基因分型、二代测序和药物基因组学研究等。DNA的得率、片段大小与样品类型、储存条件及储存时间有很大关系。

自备试剂： 1. 康为全自动核酸提取仪（CWE2100）

2. 96 DW PLate（CW2523）、 8 channel Comb（CW2524） 3. 无水乙醇、异丙醇

实验前准备及重要注意事项

1. 获得样品后，要尽快将样品在4%-10%的福尔马林中固定，固定时间以14-24小时为 宜，时间过长易导致基因组断裂，影响下游实验。如果甲醛固定时间过长或样本存 放时间过久（＞1年）则易导致DNA完整性受损，无法扩出长片段。

2. 确保包埋前的样品彻底脱水，残留的福尔马林会抑制Proteinase K的作用。

3. 第一次使用前应按试剂瓶标签说明先在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。

4. 使用前请检查Buffer GTL、Buffer GL和Buffer DS是否出现结晶或者沉淀，如有结晶 或者沉淀， 请将Buffer GTL、Buffer GL和Buffer DS于56℃水浴重新溶解。

5. 如果下游实验对RNA污染比较敏感，可以在加入Buffer GL前加入2 μL DNase-Free的 RNase A（100 mg/mL），试剂盒中的RNase A如果长时间不用，建议-20℃保存。

6. 实验开始前将水浴锅或恒温混匀仪预热至56℃。

7. Magbeads PN严禁冰冻和高速离心，否则可能会对Magbeads PN造成不可逆的损 害。 Magbeads PN每次使用时请充分振荡混合均匀。

操作步骤

一、石蜡包埋样本：

1. 用手术刀将组织块中多余的石蜡修剪掉，露出组织后切成5-10 µm的薄片。

2. 取约1×1 cm²的切片（共约3-8片切片）置于离心管（自备）中，加入160 μL Buffer DS，涡旋震荡10秒，再加入180 μL Buffer GTL和20 μL Proteinase K，涡旋震荡10 秒。 12000 rpm ，25℃ 离心1分钟。

注意：1 ) 如果样品表面已经暴露在空气中，请将接触空气的2-3片弃掉不用。

2）DS低于18℃会凝固，如果凝固不影响下面的实验。

3. 56℃孵育1小时，直至样品完全溶解。 90℃孵育1小时。样品室温静置30秒后25℃、 12000 rpm离心1分钟，用移液器沿管壁小心吸取下层水相（约180μL）于新离心管 中，尽量避免吸入蜡液和管底沉淀。

注意：1）56℃孵育后的样品可置于室温，直至水浴锅或干浴锅温度达到90℃后再把样品置于90℃孵 育。

2）可选步骤：加入7 μL UNG（1 U/μL），50℃,5min ，不震荡。此步骤的目的是降低低频发生的 C>T | G>A转换（人为突变），同时有效保留真实发生的突变，从而使假阳性风险降至最低。UNG本试 剂盒并未提供，如果需要可单独向本公司订购，货号：CW0951S。

4. 可选步骤，如果少量RNA的存在会对下游实验造成影响，建议向水相中加入2 μL 浓 度为100 mg/mL的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置2 min。

5. 加入20 uL Proteinase K ，65℃, 450 rpm孵育15 min ，形成Lysate。

二、福尔马林等固定液中的样本：

1. 取约20 mg的样本，切成小块，置于离心管中，加入500 μL 10mM PBS（PH 7.4）， 涡旋振荡， 12,000 rpm（～13,400×g）离心1分钟，弃上清，重复3次。

2. 上述管中加入180 μL Buffer GTL ， 20 μL Proteinase K，涡旋震荡混匀。

3. 56℃孵育1小时，直至样品完全溶解。 90℃孵育1小时。样品室温静置30秒后25℃、 12000 rpm离心1分钟，用移液器沿管壁小心吸取下层水相（约180μL）于新离心管 中，尽量避免吸入蜡液和管底沉淀。

注意：1）56℃孵育后的样品可置于室温，直至水浴锅或干浴锅温度达到90℃后再把样品置于90℃ 孵育。

2）可选步骤：加入7 μL UNG（1U/μL）， 50℃, 5min ，不震荡。此步骤的目的是 降低低频发生的 C>T | G>A 转换（人为突变），同时有效保留真实发生的突变，从 而使假阳性风险降至最低。UNG本试剂盒并未提供，如果需要可单独向本公司订购

4. 可选步骤，如果少量RNA的存在会对下游实验造成影响，建议向水相中加入2 μL浓 度为100 mg/mL的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置2 min。

5. 加入20 uL Proteinase K ，65℃, 450 rpm孵育15 min ，形成Lysate。

手动操作步骤：

1. 向Lysate 中加入200 μL Buffer GL并涡旋震荡混匀。

2. 向离心管中加入300 μL异丙醇与20 μL磁珠后涡旋震荡混匀5秒钟，之后将离心管固

定于25℃、 1600 rpm的恒温混匀仪上震荡结合10分钟。

3. 将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液。

4. 向离心管中加入750 μL Buffer GW1（使用前请检查是否已加入无水乙醇），涡旋震 荡5秒钟后放于25℃、 1600 rpm的恒温混匀仪上震荡结合2分钟。

5. 将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液。

6. 重复步骤4-5。

7. 向离心管中加入750 μL Buffer GW2（使用前请检查是否已加入无水乙醇），涡旋震 荡5秒钟后放于25℃、 1600 rpm的恒温混匀仪上震荡结合2分钟。

8. 将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液。

9. 重复步骤7-8。

10. 离心管短暂离心后，将其重新固定于磁力架上用移液器去除管底溶液，之后开盖室 温放置5-10分钟使乙醇充分挥发。

11. 向离心管中加入50-200 μL Buffer TE后涡旋震荡使磁珠充分悬浮于洗脱液中，之后 将离心管固定于56℃、 1600 rpm的恒温混匀上震荡洗脱10分钟。

12. 将离心管固定于磁力架上静置2分钟，之后将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存 备用。

与CWE2100全自动核酸提取仪匹配

1. 按下表向96 DW深孔板中加入试剂：

注意：在1&7列中，可以先将Magbeads PN与异丙醇按表中比例混匀后再加入。

2. 将磁套与96 DW深孔板放入CWE2100中，运行“FFPE DNA程序”。

3. 约30分钟后程序运行结束，将96DW深孔板和磁套从仪器中取出，把“6&12 Colume” 中的洗脱产物转移至离心管中-20℃保存备用。

附： FFPE DNA程序