新型固定组织基因组DNA提取试剂盒说明书
货号:M03930
规格：50T
英文名称：NuClean FFPE DNA Kit
保存：Spin Columns DF室温下可保存2个月;2-8℃保存1年,其余组分常温 (15-30℃)保存
产品组成：
Component | 50 preps |
Buffer DS | 30 mL |
Buffer GTL | 15 mL |
Buffer GL | 15 mL |
Buffer GW1 (concentrate) | 13 mL |
Buffer GW2 (concentrate) | 15 mL |
Buffer TE | 10 mL |
Proteinase K | 2×25 mg |
Proteinase K Storage Buffer | 2×1.25 mL |
RNase A (100 mg/mL) | 0.4 mL |
Spin Columns DF With Collection Tubes | 50 |
Centrifuge Tubes（L-1.5 mL） | 50 |
产品简介
本试剂盒适用于从福尔马林固定、石蜡包埋组织中有效纯化基因组DNA。本品使用专门优化脱蜡剂和裂解液，释放福尔马林固定或组织切片样本中的DNA，不涉及有机试剂二甲苯，无需过夜操作；消化后的样品在较高的温度孵育后，去除游离DNA的福尔马林交联，有效提高DNA的产量和纯度；优化的缓冲系统使裂解液中的DNA可特异结合到吸附膜上，抑制剂通过两步漂洗步骤有效去除，最后使用低盐缓冲液或水洗脱，即可获得高纯度DNA。同时配置高效微量吸附柱，洗脱体积可低至20μL。经过纯化的DNA可以直接用于PCR、Real-time PCR、SNP 基因分型、STR基因分型、二代测序和药物基因组学研究等。从福尔马林固定、石蜡包埋样本中分离的DNA分子量通常低于新鲜或冷冻样本中
的DNA。DNA片段化的程度取决于样本类型、储存时间以及固定的条件。
自备试剂：无水乙醇
实验前准备及重要注意事项
1. 获得样品后，要尽快将样品在4%-10%的福尔马林中固定，固定时间以14-24小时为宜，时间过长易导致基因组断裂，影响下游实验。如果甲醛固定时间过长或样本存放时间过久（＞1年）则易导致DNA完整性受损，无法扩出长片段。
2. 确保包埋前的样品彻底脱水，残留的福尔马林会抑制Proteinase K的作用。
3. 向Proteinase K中加入1.25 mL Proteinase K Storage Buffer使其溶解，-20℃保存。配制好的Proteinase K勿长时间室温放置，以免影响其活性。
4. 第一次使用前应按试剂瓶标签说明先在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。
5. 使用前请检查Buffer GTL、Buffer GL和Buffer DS是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将Buffer GTL、Buffer GL和Buffer DS于56℃水浴重新溶解。
6. 实验开始前将水浴锅或恒温混匀仪预热至56℃，离心机保持25℃。
7. 如果下游实验需要降低低频发生的 C>T | G>A 转换（人为突变），将假阳性风险降至最低，可以在90℃孵育1小时后加入7 μL UNG（1U/uL），UNG本试剂盒并未提供，如果需要可单独向本公司订购EZ1141。
操作步骤
1．样本处理：
1a. 石蜡包埋样本：用手术刀将组织块中多余的石蜡修剪掉，露出组织后切成5-10 µm的薄片。取约1×1 cm2的切片（共约4-5片切片）置于离心管（自备）中，加入160 μL Buffer DS，涡旋震荡10秒，再加入180 μL Buffer GTL和20μL Proteinase K，涡旋震荡10秒。12000 rpm，25℃ 离心1分钟。
注意：
1 ) 如果样品表面已经暴露在空气中，请将接触空气的2-3片弃掉不用。
2）DS低于18℃会凝固，如果凝固不影响下面的实验。
1b. 福尔马林等固定液中的样本：取约20 mg的样本，切成小块，置于离心管中，加入500 μL 10mM PBS（pH7.4），涡旋振荡，12000 rpm 离心1分钟，弃上清，重复3 次。加入180 μL Buffer GTL，20 μL Proteinase K，涡旋震荡混匀。
2. 56℃孵育1小时，直至样品完全溶解。90℃孵育1小时。12000 rpm，25℃ 离心1分钟，用移液器沿管壁小心吸取下层水相（约180μL）于新离心管中，尽量避免吸入管底沉淀和上层蜡液。
注意：
1）56℃孵育后的样品可置于室温，直至水浴锅或干浴锅温度达到90℃后再把样品置于90℃孵育。
2）可选步骤：加入7 μL UNG（1U/μL），50℃，5 min ，不震荡。此步骤的目的是降低低频发生的 C>T | G>A转换（人为突变），同时有效保留真实发生的突变，从而使假阳性风险降至最低。UNG本试剂盒并未提供，如果需要可单独向本公司订购，货号：EZ1141。
3. 可选步骤：如需除去RNA，可将样品温度降到室温后，加入2 μL浓度为100 mg/mL 的RNase A 溶液，震荡混匀，室温放置2分钟。
4. 加入20 μL Proteinase K，65℃，450 rpm孵育15 min 。
5. 加入200 μL Buffer GL，涡旋震荡混匀后加入200 μL无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。
短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
注意：
1）加入Buffer GL和无水乙醇后要立即充分混匀。
2）加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。
3）如果需要对多个样品进行操作，可以将Buffer GL和无水乙醇事先混匀后加样。
6. 将步骤5所得溶液全部加入已装入收集管的吸附柱（Spin Columns DF）中，25℃ ，12000 rpm 离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7. 向吸附柱中加入500 μL Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12000 rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
8. 向吸附柱中加入500 μL Buffer GW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12000 rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤8。
9. 12000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。
注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应。
10. 将吸附柱置于一个新的1.5 mL收集管中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-100 μL Buffer TE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12000 rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
注意：
1）洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5，pH 值
低于7.0时洗脱效率不高。
2）如果要提高DNA的终浓度，可以将步骤10所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，室温放置2分
钟，12000 rpm离心1分钟。