2.5M 3-AT溶液
货号：W00330
规格：5mL*5/50mL/100mL
保存：-20℃，有效期 24 个月，蓝冰运输。
产品说明：
3-AT 是酵母 HIS3 蛋白（组氨酸）的竞争性抑制剂，可抑制组氨酸的合成。HIS3 是酵母单杂，双杂，三杂实验的报告基因。HIS3 报告基因在酵母中会有微弱的泄露表达，即报告基因没有被激活时的本底表达。此外，某些蛋白或 DNA 片段在酵母中有自激活现象，在没有互作发生时也可以激活报告基因，这种自激活现象导致酵母互作实验产生很多假阳性。这时需要在培养基中加入适量的 3-AT 以抑制 HIS3 的本底表达或抑制自激活，使得背景降低，或者增加使用报告基因如 ADE2 来进行更加严格的筛选，然后再确定是否存在互作。加入的 3-AT 浓度过高，比较弱的相互作用可能被抑制，因此需要筛选 3-AT 的最适浓度。
本产品为 3-AT 母液，浓度为 2.5 M，经过过滤除菌处理。
使用说明：
酵母杂交实验
一、自激活检测
1. 设置 3-AT 浓度梯度。在 0-80 mM 的浓度范围内设置梯度，如 0、10、20、30、40、50、60、70、80 mM。
注：需设有 0 浓度的 3-AT，用于检测菌株生长。
2. 灭菌固体培养基，待培养基冷却至 50-55℃，取 20-25 mL 培养基，加入 3-AT 母液，摇匀后倒平板（Φ90 mm），短期可于 4℃冰箱保存。
注：培养基平板过薄会影响 3-AT 抑制效果。不同 3-AT 浓度的培养基体积需保持一致，如均为 20 mL。倒板时注意让平板平整。
3. 若后续为互作验证实验，建议将菌液 OD600调至 0.2，后稀释至 0.02、0.002、0.0002，分别取 10 μL 菌液进行点板。若后续为筛库实验，建议将菌液 OD600 调至 0.002，取 100 μL 菌液进行涂板。
4. 30℃培养 3-5 d，观察酵母在不同 3-AT 浓度平板上生长情况，从而确定 3-AT 最佳使用浓度，用于后期互作实验。
注：在不同浓度 3-AT 平板上，OD600 为 0.002 时出现的酵母菌斑最少或完全没有，即为 3-AT 最佳使用浓度（最佳抑菌浓度、最小抑菌浓度、本底表达浓度、自激活浓度）。一般情况下互作验证实验 3-AT 浓度不宜超过 100 mM，筛库实验 3-AT 浓度不宜超过 80 mM。
二、互作验证/筛库
1. 灭菌固体培养基，待培养基冷却至 50-55℃，根据自激活检测结果加入3-AT母液，摇匀后倒平板，短期可于4℃冰箱保存。
注 1：互作验证实验取20-25 mL 培养基，倒平板（Φ90mm）。筛库实验取 70-75 mL培养基，倒平板（Φ150mm）。
注 2：筛库实验建议，与自激活浓度相比，筛库平板 3-AT 浓度应高出 5 mM。
2. 若为互作验证实验，建议将菌液 OD600调至 0.2，后稀释至 0.02、0.002、0.0002，取10uL菌液进行点板。若为筛库实验，将菌液重悬后，取 150uL 菌液进行涂板。
3. 30℃培养 3-5 d，观察酵母在平板上生长情况。
注意事项：
1. 如果 80 mM 浓度的 3-AT平板上有酵母生长，说明自激活活性太高，不能用于双杂交筛选。
2. 诱饵蛋白能够单独激活报告基因的表达，该蛋白如果是具有转录激活域一个转录因子，需要去掉转录激活结构域。如果不是转录因子但仍具有较强的转录激活活性，需要将诱饵蛋白具有激活活性的区域去除，但这样操作有可能影响蛋白间的互作。
3. 注意无菌操作，避免微生物污染。