大豆原生质体制备及转化试剂盒说明书
货号：W18600
规格：5T
英文名称：Soybean protoplasm preparation and Transformation Kit
保存：A 盒，-20 ℃储存；B 盒，常温储存。
产品说明（仅供参考）:
该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。
此试剂盒主要通过纤维素酶和果胶酶消化植物细胞壁，再经过滤洗涤去除杂质获得原生
质体，通过聚乙二醇（PEG）法进行原生质体融合。适用于从 15 d 的大豆幼苗叶片中分离原
生质体。获得的原生质体可用于蛋白的亚细胞定位，验证蛋白间的相互作用，转录因子的转
录调控等。本试剂盒包含原生质体制备和转化需要的全部试剂，按照每次 10 mL 酶解液的使
用量，可供 5 次原生质体制备以及 120 个转化反应。
产品组成：
组份编号 | 组分名称 | 5T | 储存温度 | |
PPT151- 1 | 酶解缓冲液 EC（Buffer EC） | 100 mL | ||
A 盒 | PPT151-2 PPT151-3 | 酶 E1（Enzyme 1） 酶 E3（Enzyme 3） | 1.5 g 0.35 g | -20 ℃ |
PPT151-4 | BSA（10%） | 2.5 mL | ||
PPT151-5 | 培养液 CMS（Buffer CMS） | 120 mL×6 | ||
PPT151-6 | 重悬液 RS（Buffer RS） | 30 mL | ||
B 盒 PPT151-7 | 转化液 TP（Buffer TP） | 36 mL | RT | |
PPT151-8 | β-巯基乙醇 | 100 μL | ||
PPT151-9 | 细胞筛 | 10 个 | ||
使用说明：
一、准备工作
1. 需要自行准备的材料：
锋利刀片；血球计数板；50 mL 离心管；2 mL 离心管，切过尖的灭菌蓝枪头和黄枪头、10 uL 白枪头（进口的更佳）。
2. 酶解液配制
配制顺序 | 组分 | 20 mL 体积 |
酶解缓冲液 EC（Buffer EC） | 16 mL | |
第一步 | 酶 E1（Enzyme 1） 酶 E3（Enzyme 3） | 0.3 g 0.06 g |
第二步 | 混匀后 55 ℃水浴 10 min ，期间颠倒混匀 2-3 次， 冷却室温后加入以下成分 | |
第三步 | BSA（10%） β-巯基乙醇 | 200 µL 7. 14 µL |
第四步 | 加酶解缓冲液 EC（Buffer EC）定容（约 4 mL） | |
第五步 | 过滤除菌（可选步骤） |
注：
1. 酶解液必须现配现用。
2. 根据实验的需要选择酶解液是否需要过滤除菌。
二、原生质体的分离制备
1. 准备 15 d 的大豆幼苗叶片，优选第 1 和 2 对叶片（黄化的原生质体更稳定）。建议使用无
菌播种得到的大豆幼苗，效果更佳。
注：若使用土培苗，最好用无菌 ddH2O 冲洗擦干后使用，减少细菌的繁殖。
2. 取 2-4 个大豆叶片（样品量约 1 g，可适当增加），用锋利刀片平行主叶脉，切成 0.5-1.0 mm的细丝。
3. 将切好的细丝放入装有 20 mL 酶解液的 50 mL 容积的小烧杯中，锡箔纸包裹，烧杯口留洞，抽真空 30 min 分钟（15Hg/50kpa/0.5）。
注：避光步骤可防止原生质体重新生长出细胞壁，植物细胞壁不利于后续转化。
4. 避光 28 ℃，45 rpm 摇床上孵育 5-6 h。收集原生质体前，80 rpm 摇动 5 min，让原生质体完全释放出来。
5. 用 1 mL 培养液 CMS 润洗细胞筛后，弃废液。
6. 将酶解后的产物用细胞筛过滤，用镊子或无菌枪头轻轻挤压酶解物帮助充分释放原生质体，此时肉眼可见浓绿色液体滴落（挤压步骤十分重要）。用 5 mL 的培养液 CMS 冲洗酶解器皿和未消化的叶片 2 次（用切过尖的蓝枪头冲洗），将所有的液体收集到一个 50 mL 离心 管中。可选：也可以在第一次过滤后，小心将植物组织转移到锥形瓶中，加入 10 mL 的培养液 CMS， 在 28 ℃摇床 80 rpm 摇动 5 min，第二次过滤后，再用 5 mL 培养液 CMS 冲洗酶解器皿和未消化的叶片 2 次。二次重悬过滤可以一定程度提高原生质体的产率，增加转化数。
注：1. 操作过程尽可能轻柔，避免剧烈震荡，过滤时可以将 50 mL 离心管倾斜 70°，可以缓冲溶液下落时产生的碰撞力，防止原生质体破碎。2. 黄化苗酶解后的原生质体不呈绿色，过滤完成后，可以取一滴酶解液镜检，如果细胞圆而发亮，则健康，可继续进行实验；如果细胞扁且发黑，则弃去。
7. 选用水平转子，室温 150 g 离心 3 min，升速 3，降速 3，去除上清（管中绿色沉淀即为原 生质体）。
注：离心时，可调低离心机的升速和降速。升速过快，原生质体可能离到管壁上导致破碎；降速过快，可能导致管底原生质体悬起。且过快的升降速会使原生质体破碎。建议升速和降速分别都使用 3。
8. 加入 10 mL 培养液 CMS 温柔重悬位于底部的原生质体（切过尖的蓝枪头），150 g 离心 3 min，升速 3，降速 3，去上清。
9. 显微镜下观察原生质体的状态和血球计数板计数。
血球计数板的使用：
如下图所示，在血球计数板上加上一个盖玻片，分别从两侧凹槽加入样品。使用中央区
域长和宽都是 1 mm 的方形区域进行计数（25 个中方格）。分别统计正方形四个顶角和中央
的小正方形的细胞数量，取平均值再乘以 25（正方形被分成了 25 个小正方形），计算该区
域的细胞数量，该区域的体积为 0.1 µL（长 1 mm，宽 1 mm，高 0.1 mm）。计算获得的细胞数量。原生质体浓度（个/mL）=25 个中方格原生质体数×10 4×稀释倍数。
10. 用相应体积的重悬液 RS 重悬原生质体，调整原生质体密度为 2×10 5 /mL。（根据细胞数量和所需反应数，加入对应的重悬液 RS 体积，100 uL/1 个反应
三、原生质体的转化
1. 在 2 mL 的灭菌圆底离心管中加入 3-20 µg（总体积不超过 10 µL，根据实验需要用无菌ddH2O 补齐）纯化后的高质量质粒（建议去内毒素），随后加入 100 µL 调整好浓度的原生质体，轻弹充分混匀。
2. 加入 110 µL 的转化液 TP，轻弹混匀或切过尖的蓝枪头轻轻吸打混匀，过程中应避免产生气泡，室温孵育 3-30 min（常规实验不超过 15 min）。
注：去内毒素质粒对转化效率有极明显提升（近 3 倍），建议购买 PE034 去内毒素质粒大提
试剂盒（吸附柱法）。转化液 TP 较难溶解，需 65 ℃水浴完全溶解后（约 10 min），冷却至
室温后使用。原生质体与转化液 TP 较难混匀，请耐心缓慢的吸打，以至充分混匀，保证转化效率。
3. 加入 500 uL 培养液 CMS，轻柔颠倒混匀，终止转化。室温 150 g 离心 3 min，升速降速 3，在不损失原生质体的情况下，尽可能去上清。
4. 加入 500 uL 培养液 CMS 重悬原生质体，室温 150 g 离心 3 min，升速 3，降速 3，去上清。
四、原生质体的培养和收集
1. 加入 500 uL 培养液 CMS 培养悬浮细胞。将离心管水平室温避光放置，孵育 12-16 h。（或使用细胞培养板培养原生质体。用 1 mL 的 10% BSA 润洗细胞培养板后，放入 1 mL 培养液CMS。用 1 mL 培养液 CMS 悬浮细胞后，放入细胞培养板中，水平室温避光放置，孵育 12-16 h。）
2. 收集细胞时，缓慢拿起离心管，用枪头将附着在管壁上的细胞轻轻悬起，离心管室温垂直静置 3 min 后再离心，室温 100 g 离心 3 min，升速 3，降速 3，去除大部分培养液 CMS，收集原生质体，用于后续实验。
注意事项：
1. 分离制备的原生质体没有细胞壁的保护，非常脆弱，整个实验操作过程中动作尽可能轻柔。
2. 为了避免原生质体离心时贴在管壁，建议整个实验过程使用水平转子。
3. 实验过程中尽可能使用切过尖的 1 mL 蓝枪头，保证平滑。因为其尖端的孔径较大，会避免原生质体破裂。
4. 若无水平转子，可适当调整离心力、离心时间、升降速，以保证实验成功。
5. 转化时建议添加空载荧光对照，以验证操作步骤无问题。
6. 土培的成株期植株的组织分离效果会偏差，属于正常现象。
7. 在培养悬浮细胞时，建议使用细胞培养板，可使蛋白表达量提高。
8. 因大豆叶片表面有绒毛，极易浮于酶解液之上，导致酶解不充分。因此本实验中的抽真空步骤极为重要，不能省去。
9. 经验证，酶解时间必须大于 5 h，否则将酶解失败。