水稻原生质体制备及转化试剂盒（20 mL/T）说明书
货号：W20890
规格：5T
英文名称：Rice Protoplast Preparation and Transformation Kit
保存：A 盒，-20 ℃储存；B 盒，常温储存。
产品组成：
组份编号 组分名称 5T 保存 | ||||
WP8205- 1 | 酶解缓冲液 EC（Buffer EC）80 mL | |||
WP8205-2 | 酶 E1（Enzyme 1） 1.5 g | |||
A 盒 | WP8205-3 | 酶 E2（Enzyme 2） 0.75 g | -20 ℃ | |
WP8205-4 | BSA（10%） 2.5 mL | |||
WP8205-5 | AMP（100 mg/mL） 1 mL | |||
WP8205-6 | 培养液 CM（Buffer CM） 100 mL×4 | |||
WP8205-7 | 重悬液 RS（Buffer RS） 15 mL | |||
B 盒 | WP8205-8 | 转化液 TP（Buffer TP） 18 mL | RT | |
WP8205-9 | 还原剂 100 µL | |||
WP8205- 10 | 细胞筛 5 个 | |||
产品说明（仅供参考）:
此试剂盒主要通过纤维素酶和离析酶消化植物细胞壁获得原生质体。适用于从 7-14 d 的水稻幼苗中分离原生质体。获得的原生质体可用于蛋白的亚细胞定位，验证蛋白间的相互作用，转录因子的转录调控等。本试剂盒包含原生质体制备和转化需要的全部试剂，按照每次20 mL 酶解液的使用量，可供 5 次原生质体制备以及 120 个转化反应。
使用说明：
一、准备工作
1. 需要自行准备的材料：
锋利刀片；血球计数板；50 mL 离心管；2 mL 离心管，切过尖的灭菌蓝枪头和黄枪头、10 μL 白枪头（进口的更佳）。
- 酶解液配制
酶解缓冲液 EC | 16 mL | |
第一步 | 酶 E1（Enzyme 1） 酶 E2（Enzyme 2） | 0.3 g 0. 15 g |
第二步 | 混匀后 55 ℃水浴 10 min ，期间颠倒混匀 2-3 次， 冷却室温后加入以下成分 | |
第三步 | BSA（10%） 还原剂 Amp（100 mg/mL） | 200 µL 7. 14 µL 10 µL |
第四步 | 加去离子水定容 | |
第五步 | 过滤除菌（可选步骤） |
注：
1. 酶解液必须现配现用。
2. 根据实验的需要选择酶解液是否需要过滤除菌。
3. 将培养液 CM 放在冰上预冷，便于后续使用。
二、原生质体的分离制备
1. 准备 7-14 d 的水稻幼苗（黄化的原生质体更稳定），建议使用无菌播种得到的水稻幼苗，可保证材料的新鲜健康与均一性，效果更佳。
注：若使用土培苗，最好用无菌 ddH2O 冲洗擦干后使用，减少细菌的繁殖。
2. 取 5-10 株水稻幼苗（样品量约 1 g，可适当增加），去除其根与叶尖，尽可能保留基部的分生组织。用锋利刀片垂直生长方向，切成 0.5-1.0 mm 的小段。
3. 将切好的小段放入装有 20 mL 酶解液的 50 mL 容积的小烧杯中，锡箔纸包裹，烧杯口留洞，抽真空 30 min（15 Hg/50 kpa/0.5）。
注：避光步骤可防止原生质体重新生长出细胞壁，植物细胞壁不利于后续转化。
4. 避光 28 ℃，45 rpm 摇床上孵育 4-5 h。收集原生质体前，80 rpm 摇动 5 min，让原生质体完全释放出来。
5. 用 1 mL 培养液 CM 润洗细胞筛后，弃废液。
6. 将酶解后的产物用细胞筛过滤，用镊子或无菌枪头轻轻挤压酶解物帮助充分释放原生质体，此时肉眼可见浓绿色液体滴落（挤压步骤十分重要）。用 5 mL 的培养液 CM 冲洗酶解器皿和未消化的叶片 2 次（用切过尖的蓝枪头冲洗），将所有的液体收集到一个 50 mL 离心管中。
可选：也可以在第一次过滤后，小心将植物组织转移到锥形瓶中，加入 10 mL 的培养液 CM， 在 28 ℃摇床 80 rpm 摇动 5 min，第二次过滤后，再用 5 mL 培养液 CM 冲洗酶解器皿和未消化的叶片 2 次。二次重悬过滤可以一定程度提高原生质体的产率，增加转化数。
注：1. 操作过程尽可能轻柔，避免剧烈震荡，过滤时可以将 50 mL 离心管倾斜 70°，可以缓冲溶液下落时产生的碰撞力，防止原生质体破碎。2. 黄化苗酶解后的原生质体不呈绿色，过滤完成后，可以取一滴酶解液镜检，如果细胞圆而发亮，则健康，可继续进行实验；如果细胞扁且发黑，则弃去。
7. 选用水平转子，室温 150 g 离心 5 min，升速 3，降速 3，去除上清（管中绿色沉淀即为原生质体）。
注：离心时，可调低离心机的升速和降速。升速过快，原生质体可能离到管壁上导致破碎；降速过快，可能导致管底原生质体悬起。且过快的升降速会使原生质体破碎。建议升速和降速分别都使用 3。
8. 加入 10 mL 培养液 CM 温柔重悬位于底部的原生质体（切过尖的蓝枪头），150 g 离心 3 min，
升速 3，降速 3，去上清。
9. 加入 1 mL 培养液 CM，重悬原生质体，冰上避光静置 30 min。
10. 在离心前，可以显微镜下观察原生质体的状态和血球计数板计数。
血球计数板的使用：
如下图所示，在血球计数板上加上一个盖玻片，分别从两侧凹槽加入样品。使用中央区域长和宽都是 1 mm 的方形区域进行计数（25 个中方格）。分别统计正方形四个顶角和中央的小正方形的细胞数量，取平均值再乘以 25（正方形被分成了 25 个小正方形），计算该区域的细胞数量，该区域的体积为 0.1 µL（长 1 mm，宽 1 mm，高 0.1 mm）。计算获得的细胞数量。原生质体浓度（个/mL）=25 个中方格原生质体数×10 4×稀释倍数。
11. 150 g 离心 3 min，升速 3，降速 3，去上清，用相应体积的重悬液 RS 重悬原生质体，调整原生质体密度为 2×10 5 /mL。（根据细胞数量和所需反应数，加入对应的重悬液 RS 体积，100 μL/1 个反应）
三、原生质体的转化
1. 在 2 mL 的灭菌圆底离心管中加入 3-20 µg（总体积不超过 10 µL，根据实验需要用无菌ddH2O 补齐）纯化后的高质量质粒（建议去内毒素），随后加入 100 µL 调整好浓度的原生质体，轻弹充分混匀。
2. 加入 110 µL 的转化液 TP，轻弹混匀或切过尖的蓝枪头轻轻吸打混匀，过程中应避免产生气泡，室温孵育 3-30 min（常规实验不超过 15 min）。
注：去内毒素质粒对转化效率有极明显提升（近 3 倍），建议购买去内毒素质粒大提试剂盒（吸附柱法）。转化液 TP 较难溶解，需 65 ℃水浴完全溶解后（约 10 min），冷却至室温后使用。原生质体与转化液 TP 较难混匀，请耐心缓慢的吸打，以至充分混匀，保证转化效率。
3. 加入 500 μL 培养液 CM，轻柔颠倒混匀，终止转化。室温 150 g 离心 3 min，升速降速 3，在不损失原生质体的情况下，尽可能去上清。
4. 加入 500 μL 培养液 CM 重悬原生质体，室温 150 g 离心 5 min，升速 3，降速 3，去上清。
四、原生质体的培养和收集
1. 加入 500 μL 培养液 CM 培养悬浮细胞。将离心管水平室温避光放置，孵育 12-16 h。
2. 收集细胞时，缓慢拿起离心管，用枪头将附着在管壁上的细胞轻轻悬起，离心管室温垂直
静置 3 min 后再离心，室温 150 g 离心 3 min，升速 3，降速 3，去除大部分培养液 CM，收集
原生质体，用于后续实验。
注意事项：
1. 分离制备的原生质体没有细胞壁的保护，非常脆弱，整个实验操作过程中动作尽可能轻柔。
2. 为了避免原生质体离心时贴在管壁，建议整个实验过程使用水平转子。
3. 实验过程中尽可能使用切过尖的 1 mL 蓝枪头，保证平滑。因为其尖端的孔径较大，会避
免原生质体破裂。
4. 若无水平转子，可适当调整离心力、离心时间、升降速，以保证实验成功。
5. 转化时建议添加空载荧光对照，以验证操作步骤无问题。
6. 土培的成株期植株的组织分离效果会偏差，属于正常现象